Genome wide evolutionary analyses reveal serotype specific patterns of positive selection in selected Salmonella serotypes

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The bacterium <it>Salmonella enterica </it>includes a diversity of serotypes that cause disease in humans and different animal species. Some <it>Salmonella </it>serotypes show a broad host range, some are host restricted and exclusively associated with one particular host, and some are associated with one particular host species, but able to cause disease in other host species and are thus considered "host adapted". Five <it>Salmonella </it>genome sequences, representing a broad host range serotype (Typhimurium), two host restricted serotypes (Typhi [two genomes] and Paratyphi) and one host adapted serotype (Choleraesuis) were used to identify core genome genes that show evidence for recombination and positive selection.</p> <p>Results</p> <p>Overall, 3323 orthologous genes were identified in all 5 <it>Salmonella </it>genomes analyzed. Use of four different methods to assess homologous recombination identified 270 genes that showed evidence for recombination with at least one of these methods (false discovery rate [FDR] <10%). After exclusion of genes with evidence for recombination, site and branch specific models identified 41 genes as showing evidence for positive selection (FDR <20%), including a number of genes with confirmed or likely roles in virulence and <it>ompC</it>, a gene encoding an outer membrane protein, which has also been found to be under positive selection in other bacteria. A total of 8, 16, 7, and 5 genes showed evidence for positive selection in Choleraesuis, Typhi, Typhimurium, and Paratyphi branch analyses, respectively. Sequencing and evolutionary analyses of four genes in an additional 42 isolates representing 23 serotypes confirmed branch specific positive selection and recombination patterns.</p> <p>Conclusion</p> <p>Our data show that, among the four serotypes analyzed, (i) less than 10% of <it>Salmonella </it>genes in the core genome show evidence for homologous recombination, (ii) a number of <it>Salmonella </it>genes are under positive selection, including genes that appear to contribute to virulence, and (iii) branch specific positive selection contributes to the evolution of host restricted <it>Salmonella </it>serotypes.</p

Moleküler Alt Tipleme Kapasitesi Kurulması

Günümüzde gıda kaynaklı salgınların tespitinde geleneksel belirleme yöntemlerinin yanı sıra genetik tipleme teknikleri de kullanılmaktadır. Önceleri serotipleme teknikleri ile yetersiz tiplendirme yapılabilirken günümüzde bakteri farklılıklarının tespitinde fenotipik ve genotipik yöntemler kullanılmaktadır. Gıda kaynaklı patojenlerinin olarak tiplenmesinde en çok kullanılanlar serotipleme ve faj tiplemedir. Fenotiplemenin yetersiz olduğu durumlarda daha hızlı, daha doğru sonuçlar veren genotipleme yöntemleri kullanılmaktadır. Bunlar içinde tüm genomun restriksiyon enzimleri ile parçalanması esasına dayanan vuruşlu alan jel elektroforezi (PFGE) altin stadart olarak kullanilmaktadir.. Alt tiplerin birbiri ile aynı veya benzer şekilde gruplaşıp gruplaşamadığı incelenmekte, gruplaşma gösteren izolatların ortak kaynaktan alınıp alınmadığına dair epidemiyolojik çalışmalar yapılmaktadır. Epidemiyolojik çalışmalar sonunda muhtemel bulaşma kaynağı olan gıda tespit edilir ve öngörülen kaynakta yapılan analizler sonucunda gözlenen gruplaşmaların salgın olup olmadığı belirlenir. Ülkemizde bu eksikliğin giderilmesi için yapılan çalışmalar çogunlukla insan klinik örneklerinin alttiplenmesi üzerinedir. Bu çalışmaların çiftlikten/tarladan çatala kadar uzanan zincirin tüm halkalarına yayılması gerelidir. Vuruşlu alan jel elektroforezi (PFGE) ile tiplendirme: Vuruşlu alan jel elektroforezi CDC PulseNet protokolüne göre yapılacaktır. Turkiye’de izole edilen gida kaynakli izolatların PFGE patternlarindan olusturluacak dendogramlari dünyada yaygın bulunan PFGE izleri ile karsilastirilacaktir. Buna ilaveten Türkiye’ye özgü PFGE izlerinin olup olmadığı incelenecektir. Izolat ile bilgiler Pathogen Tracker adlı internet ağına yüklenecektir

Çoklu İlaç Dirençli Salmonella İzolatlarındaki Plazmidlerin Çeşitliliği ve İletişim Kabiliyetleri

Salmonella enfeksiyonları insan sağlığını tehlikeye atmakla beraber kontamine olmuş gıda tedarikçilerine bağlı ekonomik masraflara da sebep olmaktadır. Son yıllarda Salmonella ve diğer Enterobacteriaceae?da görülen çoklu antimikrobiyal dirençlilik artmıştır. Çoklu antimikrobiyal dirençli türün varlığının ve yayılısının belirgin olarak artmasının sebebinin gıda dağıtım zincirinden kaynaklandığı bilinmektedir. Bununla birlikte çoklu antimikrobiyal dirençlilik kodlayan gen çeşitliliği ve bu genlerin türden türe geçişini sağlayan genetik temelli mekanizmalar hakkında çok az bilgi mevcuttur. Tamamlamış olduğumuz bu çalışmada: (i) Proje süresince toplamda 70 adet Salmonella Infantis ve 19 adet patojenik olmayan E. coliizolatı ile çalışılmıştır.Salmonella ve patojen olmayan E. coliizolatlarının fenotipik ve genotipik karakterleri saptanmıştır. İzolatlar, Vuruşlu Alan Jel Elektroforezi (PFGE) ile tiplendirilmiş, Multi Lokus Sekans Tipleri (ST) ve serotipleri belirlenmiştir. 70 adet Salmonellai zolatının hepsinin serotipinin Infantis olduğu ve ST32 MLST tipine ait olduğu belirlenirken, izolatların 9 farklı PFGE izine sahip olduğu belirlenmiştir. Çalışılan tüm E. coli izolatları da farklı bir PFGE izini ifade ederek 19 farklı çeşit iz sergilemiştir. (ii) Tüm izolatların disk difüzyon yöntemi ile fenotipik olarak, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile de genotipik olarak antimikrobiyal dirençlilik profilleri belirlenmiştir. Tüm Salmonella İnfantis izolatlarında çoklu antimikrobiyal dirençlilik saptanmıştır. Dirençli Salmonellaizolatlarında antimikrobiyal dirençliliği enkodlayan genler (?-laktam dirençlilik genleri: blaTEM-1,blaPS1E-1,blaCMY-2, amp; Kloramfenikol dirençlilik genleri: cat1, cat2, flo, cmlA; Aminoglikozid dirençlilik genleri: aadA1, aadA2, strA, strB, aacC2, aphA1- IAB;Trimetoprim dirençlilik genleri: dhfrI, dhfrXII; Sülfanomid dirençlilik genleri: sulI, sulII; Tetrasiklin dirençlilik genleri: tetA, tetB, tetG; Kinolonlar dirençlilik genleri: qnrA, qnrB, qnrS) araştırılmıştır.Sonuç olarak antimkrobiyal dirençlilik genotipik analizlerle de doğrulanmıştır. Salmonella Infantis izolatlarının virülans de özellikleri (ctdB, gatC, gogB,hlyE, pefA, ssek3, sseI, sspH, sodC, sopE, STM2759, tcfA) moleküler olarak incelenmiştir. Antimikrobiyal dirençliliği ve virülans özellikleri enkodlaya genler hem genomda hem de izole edilen plazmidlerde araştırılmıştır. (iii) Salmonella Infantis ve patojen olmayan Escherichia coli (E. coli) izolatlarında bulunan hareketli genetik elemanların çeşitliliği değerlendirilmiştir. Patojenik olmayan E.coli?lerin izole edilmesinin sebebi bu türün gıdalar için çoklu antimikrobiyal dirençliliğe sahip belirgin bir plazmid rezervuarı olmasıdır. Kullanılan tüm izolatlarda plazmid varlığı araştırılmış, mevcut plazmidler tanımlanmıştır. 70 adet SalmonellaInfantis izolatının 8 tanesinde plazmid varlığı tespit edilirken, 19 adet E. coli izolatının 14 tanesinde plazmid varlığı gözlemlenmiştir. İzole edilen Salmonella plazmidlerinin boyutları belirlenmiş ve moleküler olarak çeşitlilikleri tespit edilmiştir. Bu bağlamda 3 farklı SalmonellaInfantis plazmidi tanımlanmıştır. (iv) Antimikrobiyal dirençlilik genlerinin transferini etkileyen faktörlerin belirlenmesinde konjugasyon analizi gerçekleştirilmiştir. Duyarlı kommensal E. coli izolatına farklı gruplardaki Salmonellaizolatlarının plazmid aktarımı fenotipik ve genotipik olarak incelenmiştir. Çalışılan tüm Salmonella izolatlarından plazmid aktarımı gerçekleşmiş, kommensal E. coli izolatlarının bağırsakta antimikrobiyal dirençlilik genlerinin rezervuarı olabileceği ve yakın akrabalar arasındaki iletimin mümkün olabileceği belirlenmiştir. Antimikrobiyal dirençlilik kazanma yeteneği değişen tiplerdeki plazmidler için görülen yatay gen transferini kolaylaştıran veya kısıtlayan gen bölümleri belirlenmiştir. Çalışmamız yatay gen transferini kontrol etmeye yönelik çalışmalar için yol gösterici niteliğindedir

Gıda Kaynaklı Patojenlerde Yeni Gelişen Antimikrobiyal Direncin Belirlenmesi

Patojen mikroorganizmaların antimikrobiyal dirençliliği halk sağlığı açısından giderek artan kaygılara yol açmaktadır. Antibiyotiklerin yaygın kullanımı, gıda kaynaklı patojenlerin antimikrobiyal direnç kazanmasına neden olmaktadır. Mikroorganizmalar kromozomal mutasyonlar ve plazmidler ve transpozonlar gibi mobil genetik materyallerinin yatay gen transferi yoluyla direnç geliştirebilirler. Güncel çalışmalar kolistine karşı direnç sağlayan bir antimikrobiyal direnç geninin varlığını ortaya koymuştur. Kolistin, çoklu ilaç direnci gösteren Gram negatif patojenik bakterilere karşı son çare olarak kullanılan bir antibiyotiktir. Daha önce sadece dikey gen transferi yoluyla aktarılabildiği düşünülen kolistin direncinin, plazmid üzerinde bulunan bir gen ile yatay olarak transfer edilebildiği görülmüştür. Çalışmamızda Türkiye?de gıdalardan izole edilen Salmonella enterica subp enterica (Salmonella enterica) ve Escherichia coli izolatlarının plazmid kaynaklı kolistin direnci geliştirip geliştirmediği fenotipik ve genotipik olarak araştırılmıştır. Bu bağlamda, biyoinformatik araçlarla şimdiye kadar tespit edilen tüm mcr genlerini kapsayacak hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi in silico olarak geliştirilmiştir; (i) Çalışmamızda Ankara?nın çeşitli yerlerindeki kasap ve marketlerden Kasım 2018-Temmuz 2019 tarihleri arasında 238 tavuk örneği toplanmış ve bu örneklerden 18 S. enterica ve 36 adet E. coli ile izole edilmiştir. Bu sayı projede öngörülen izolat sayısından azdır. Bu nedenle izolatlar Ortadoğu Teknik Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü?nde bulunan kültür koleksiyonumuzdan izolat ilave edilmiştir. Sonuç olarak toplam incelenen izolat sayısı 218 Salmonella enterica ve 86 E. coli?dir. (ii) Tüm izolatlar disk difüzyon yöntemi ile tiplendirilmiştir. Dirençli Salmonella enterica ve E. coli izolatlarında antimikrobiyal dirençliliği enkodlayan genler hem genomda hem de izole edilen plazmidlerde araştırılmıştır. Sonuç olarak fenotipik özellikler genotipik analizlerle doğrulanmıştır. (iii) Kolistin direncini belirlemek için tüm izolatlara minimum inhibisyon kontranstrasyonu (MİK) testi uygulanmıştır. Kolistine fenotipik olarak direnç gösteren izolatların, kolistin dirençliliğinin plazmid kaynaklı mcr genleri tarafından mı enkodlandığı araştırılmıştır. Bu bağlamda mcr-1-5 ve mcr-9 genleri PZR ile taranmıştır. (iv) Çalışmamızın sonuna (15 Kasım 2019) kadar keşfedilmiş tüm mcr genleri ve varyantları (toplam 66 sekans) NCBI veritabanından indirilmiştir. Bu sekanslar DNASTAR paket programı kullanılarak align edilmiş ve filogenetik ağaçları incelenmiştir. Sekanslar daha sonra in silico primer tasarlanmasında kullanılmıştır. PrimerPlex paket programı yardımıyla çoklu PZR tasarımı yapılmıştır. Çoklu PZR her mcr homologu ve maksimum sayıda varyantını kapsayacak şekilde tasarlanmıştır

KANATLI ÇİFTLİKLERİNDE SALMONELLA'NIN AZALTILMASI İÇİN ALTERNATİF BİR YOL: ANTİMİKROBİYALLERİN YERİNE BAKTERİYOFAJLAR

KANATLI ÇİFTLİKLERİNDE SALMONELLA'NIN AZALTILMASI İÇİN ALTERNATİF BİR YOL: ANTİMİKROBİYALLERİN YERİNE BAKTERİYOFAJLA

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ/LİSANSÜSTÜ TEZ PROJESİ

TÜRKİYE'DEN İZOLE EDİLEN LİSTERİA MONOCYTOGENES İZOLATLARININ MOLEKÜLER KARAKTERİZASYONU VE SEROTİPLENDİRİLMES

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ/LİSANSÜSTÜ TEZ PROJESİ

ANTİMİKROBİYAL DİRENÇLİLİKLE İLGİLİ SALMONELLA PLAZMİDLERİNİN TANIMLANMASI VE MOLEKÜLER KARAKTERİZASYON