Estudios sobre la calcificación vascular medial: Efecto del envejecimiento, arsénico y fluor

La calcificación vascular se refiere al depósito de fosfatos de calcio en la pared de los vasos, generalmente en forma cristalizada, principalmente como hidroxiapatita (Trion y cols, 2004). Puede darse en la túnica íntima, como en ateromatosis y/o en la túnica media (calcificación medial o esclerosis de Mönckeberg) (Deltrano y cols, 1997). Los mecanismos que modulan la calcificación vascular aún no están totalmente claros. Proteínas asociadas al hueso han sido detectadas en tejidos vasculares calcificados, y por ello se ha propuesto que se trata de un proceso organizado y regulado, similar a la mineralización ósea (Bostrom y cols, 1993; Mohler y cols, 2001; Kockx y cols, 1998). Las células del músculo liso vascular (VSMCs) son comúnmente consideradas como las responsables de la calcificación vascular. La apoptosis de estas células parece ser también un factor importante en el proceso, mientras otros factores incluyen interacciones entre células (macrófagos y VSMCs), lípidos y concentraciones plasmáticas de fosfato inorgánico (Deltrano y cols, 1997). La calcificación arterial medial no se acompaña de acumulación de lípidos o depósitos de colesterol, y ocurre preferentemente en la población de edad avanzada, en diabetes e insuficiencia renal crónica (Nakano-Kurimoto, 2009). Esta tesis estudia la calcificación vascular como consecuencia del envejecimiento desde dos perspectivas diferentes, estudiándose en primer lugar como consecuencia del envejecimiento cronológico y en segundo lugar como consecuencia de la senescencia inducida por estrés (SIPS) por arsénico. A partir de estos estudios se ha llegado a concluir de forma general que el envejecimiento de las VSMCs tiene lugar gradualmente a medida que las células acumulan divisiones, a la vez que se desdiferencian y transdiferencian hacia un fenotipo osteogénico, favoreciendo el desarrollo de la calcificación vascular. El arsénico es capaz de desencadenar el proceso de senescencia y calcificación vascular en las VSMCs, aunque los mecanismos por los que se desarrollan estos procesos en este caso son independientes uno del otro. Finalmente, aunque sin relación con el envejecimiento, se estudió el efecto del flúor en la calcificación vascular, principalmente en relación con la ingesta de aguas fluoradas (en beneficio de la salud dental y ósea). Se observó como este elemento reduce la calcificación vascular in vitro, posiblemente como consecuencia de la modificación del proceso de cristalización e inhibición de la nucleación. Sin embargo, in vivo usando el modelo animal aceptado para calcificación vascular (ratas nefrectomizadas; Shobeiri y cols., 2010) se observó como la ingesta de agua fluorada (a dosis considerada segura por la Organización Mundial de la Salud) agrava la insuficiencia renal, lo que da lugar al incremento de la calcificación vascular

Regulación de los transportadores de fosfato mediante receptores nucleares LXR y FXR

La homeostasis del fosfato inorgánico (Pi) se controla mediante una serie de mecanismos neuroendocrinos, que actúan sobre el intestino, hueso y riñón. Estos mecanismos se alteran en situaciones patológicas como la enfermedad renal crónica, durante la cual puede generarse hiperfosfatemia. Ésta, junto a las dislipidemias, son factores asociados al desarrollo de enfermedades cardiovasculares. La nefropatía diabética combina todos estos factores, ya que la acumulación de lípidos en el riñón acelera la insuficiencia renal. El estudio de estas patologías ha permitido el descubrimiento de los receptores nucleares LXR (Liver X Receptor) y FXR (Farnesoid X Receptor), y el establecimiento de nuevas estrategias farmacológicas basadas en sus activaciones. Hemos demostrado que LXR y FXR parecen regular la expresión de los transportadores de fosfato en intestino y riñón, y así como la fosfatemia. Con respecto a los transportadores de fosfato NaPi2b y PiT1 y su importancia en la absorción intestinal de Pi, hemos demostrado que: 1) NaPi2b y PiT1 se expresan en la membrana apical de enterocitos; 2) la expresión es mayor en duodeno y yeyuno, al igual que lo es el transporte de Pi; y 3) durante la adaptación crónica a dieta baja en fosfato, la expresión NaPi2b se incrementa solamente en yeyuno, mientras que esa expresión es también máxima en la adaptación aguda a dieta alta en fosfato. Los transportadores de Pi son regulados también por FXR y LXR en células renales OK (Opossum Kidney) y en íleon de ratón, concluyendo que: 1) los agonistas de LXR reducen la expresión de NaPi2b en intestino, y de NaPi2a, NaPi2c, y PiT2 en riñón; 2) estos agonistas disminuyen la concentración de Pi en sangre e incrementan la excreción de Pi en la orina; y 3) los resultados observados en ratón, son reproducibles en el modelo celular renal, células OK, y en éstas se observa una menor expresión de NaPi4. Finalmente, hemos establecido el primer modelo celular para el estudio de los transportadores de Pi: 1) las células CaCo-2BBE expresan el transportador de fosfato NaPi2b; 2) el transporte de Pi es sodio dependiente, en condiciones fisiológicas (1 mM Pi en medio de cultivo); 3) hay un incremento de hasta 5 veces en el transporte de fosfato sodio independiente, como respuesta a medios con altas concentraciones de Pi (4 mM Pi); 4) estudios de inhibición y cinéticas de Michaelis-Menten evidencian la presencia de un nuevo transportador de Pi, sin identificar

Regulación de la Homeostasis del Fosfato: Dieta, Inhibidores e Identificación de Nuevos Transportadores

El conocimiento preciso de la homeostasis del fosfato es necesario, ya que el fosfato inorgánico (Pi) es parte constituyente de las membranas celulares, ácidos nucleicos y huesos y regula múltiples procesos como la señalización celular o el metabolismo energético. Por ello esta tesis ha intentado abordar los siguientes objetivos.En primer lugar, el control de la homeostasis del Pi se lleva a cabo por mecanismos tanto hormonales como no hormonales que se han estudiado mediante adaptaciones crónicas y cambios agudos a las concentraciones de Pi en la dieta en ratas. La hormona paratiroidea (PTH) se muestra como uno de los agentes principales en la regulación del transporte de Pi renal sobre todo frente a cambios agudos en la concentración de Pi, pero carece de efecto sobre la absorción intestinal que se mantiene regulada en su ausencia, así como la expresión de NaPi-IIb.En segundo lugar, cuando la homeostasis del Pi se altera tanto por defecto (hipofosfatemia) como por exceso (hiperfosfatemia) puede suponer graves trastornos para el organismo. Más concretamente la hipofosfatemia tiene como resultado una marcada bicarbonaturia de la cual se desconocen sus causas. Por ello se ha estudiado la posible implicación del intercambiador NHE3 en la privación de Pi en células OK-P y en ratas alimentadas con una dieta de 0,1% de Pi. Los resultados indican una posible disminución de la actividad de NHE3 en células OK-P con un aumento de su fosforilación en Serina-552 tanto en OK-P como en ratas adaptadas durante 1 semana a 0,1% de Pi. Sin embargo, a 8 semanas dicho efecto desaparece y se produce una marcada remodelación ósea en respuesta a una privación de Pi prolongada. Por otro lado, la toxicidad derivada de la hiperfosfatemia hace imprescindible la búsqueda y caracterización de inhibidores específicos del transporte de Pi como por ejemplo NAD, cuyo mecanismo de acción permanece siendo una incógnita. En BBMV de corteza renal y yeyuno se observa inhibición del transporte de Pi únicamente cuando son preincubadas con NAD+ y NADH tanto a temperatura ambiente como a 4C con un mecanismo de inhibición de tipo competitivo. Sin embargo, dicha inhibición en el transporte de Pi no se reproduce en ovocitos que expresan los transportadores conocidos de Pi. Además, el uso de furosemida en ovocitos que expresan la familia Slc34 causa inhibición del transporte de Pi e incluso su administración en ratas produce aumento en la excreción renal de Pi, por lo que abre nuevas posibilidades en su utilización.Para finalizar, existen todavía múltiples incógnitas respecto a la identidad molecular de algunos de los transportadores implicados en el transporte de Pi sobretodo en la absorción intestinal y en la membrana basolateral de las células. Por ello en este último estudio sobre la identificación de nuevos transportadores de Pi se ha utilizado el sistema de expresión heteróloga en ovocitos de Xenopus laevis. Los resultados obtenidos en ovocitos indican la posibilidad de que Slc4a1 actúe como un canal de salida de Pi, aunque no se ha podido desentrañar su relevancia in vivo, ya que no se han encontrado cambios en su expresión en ratas adaptadas a diferentes concentraciones de Pi en la dieta.<br /

Mecanismos de calcificación vascular medial en uremia e hiperfosfatemia

La calcificación vascular medial (CVM) es un proceso de esclerosis de la pared de las arterias asociada a la enfermedad renal crónica (ERC) entre otras. En esta tesis se ha estudiado los cambios tempranos durante la CVM en el modelo de nefrectomía (NX) de 5/6 en rata, intentando esclarecer así mismo el orden de los eventos que aparecen de forma temprana. Por otro lado se ha llevado a cabo un análisis de los sucesos que tienen lugar en el método de calcificación de células de la musculatura lisa vascular (VSMC) in vitro con elevada concentración de fosfato en el medio, intentando esclarecer su correlación con los sucesos in vivo y formulando un protocolo de trabajo lo más parecido posible a los procesos fisiopatológicos que ocurren in vivo. Finalmente, debido a la importancia de la hiperfosfatemia en el avance de la CVM, se ha llevado a cabo una exhaustiva caracterización exhaustiva el transporte de fosfato en el principal tipo celular presente en la túnica media de las arterias (y que además participa activamente en la CVM), las VSMC. Entre los resultados más trascendentales de esta tesis se encuentra la localización de cambios genéticos y proteicos en las aortas, así como plasmáticos anteriores al aumento del calcio en las mismas, aportando también un orden de sucesos en los momentos más iniciales de la CVM in vivo. Así mismo se ha demostrado que los protocolos de calcificación de VSMC in vitro se basan en precipitaciones homogéneas sin relación con los procesos in vivo, y hemos propuesto las condiciones mínimas que deben utilizarse. Finalmente, se ha avanzado en la descripción del transporte Na-independiente de Pi en VSMC, se han aportado datos nuevos sobre los transportadores Na-dependientes (NaPi III), y se ha caracterizado por primera vez el transporte de salida cloro-dependiente de fosfato en VSMC