Identification of an ASC oligomerization inhibitor for the treatment of inflammatory diseases

The ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (CARD)) protein is an scaffold component of different inflammasomes, intracellular multiprotein platforms of the innate immune system that are activated in response to pathogens or intracellular damage. The formation of ASC specks, initiated by different inflammasome receptors, promotes the recruitment and activation of procaspase-1, thereby triggering pyroptotic inflammatory cell death and pro-inflammatory cytokine release. Here we describe MM01 as the first-in-class small-molecule inhibitor of ASC that interferes with ASC speck formation. MM01 inhibition of ASC oligomerization prevents activation of procaspase-1 in vitro and inhibits the activation of different ASC-dependent inflammasomes in cell lines and primary cultures. Furthermore, MM01 inhibits inflammation in vivo in a mouse model of inflammasome-induced peritonitis. Overall, we highlight MM01 as a novel broad-spectrum inflammasome inhibitor for the potential treatment of multifactorial diseases involving the dysregulation of multiple inflammasomes

Identification of NLRP3 PYD Homo-Oligomerization Inhibitors with Anti-Inflammatory Activity

[EN] Inflammasomes are multiprotein complexes that represent critical elements of the inflammatory response. The dysregulation of the best-characterized complex, the NLRP3 inflammasome, has been linked to the pathogenesis of diseases such as multiple sclerosis, type 2 diabetes mellitus, Alzheimer's disease, and cancer. While there exist molecular inhibitors specific for the various components of inflammasome complexes, no currently reported inhibitors specifically target NLRP3(PYD) homo-oligomerization. In the present study, we describe the identification of QM380 and QM381 as NLRP3(PYD) homo-oligomerization inhibitors after screening small molecules from the MyriaScreen library using a split-luciferase complementation assay. Our results demonstrate that these NLRP3(PYD) inhibitors interfere with ASC speck formation, inhibit pro-inflammatory cytokine IL1-beta release, and decrease pyroptotic cell death. We employed spectroscopic techniques and computational docking analyses with QM380 and QM381 and the PYD domain to confirm the experimental results and predict possible mechanisms underlying the inhibition of NLRP3(PYD) homo-interactions.This research was funded by EC-funded RISE (EPIC 690939), Spanish Ministry of Economy and Competitiveness, FEDER (SAF2017-84689-R), Generalitat Valenciana (PROMETEO/2019/065), research council of Tarbiat Modares University (#IG/39803).Moasses Ghafary, S.; Soriano-Teruel, P.; Lotfollahzadeh, S.; Sancho, M.; Serrano-Candelas, E.; Karami, F.; Barigye, SJ.... (2022). Identification of NLRP3 PYD Homo-Oligomerization Inhibitors with Anti-Inflammatory Activity. International Journal of Molecular Sciences. 23(3):1-15. https://doi.org/10.3390/ijms2303165111523

Inflammatory Tumor Microenvironment as target in the design of nanoconjugates for the treatment of advanced breast cancer

[ES] Esta tesis doctoral titulada "El microambiente tumoral inflamatorio como objetivo en el diseño de nanoconjugados para el tratamiento del cáncer de mama avanzado" se centra en la evaluación de un nuevo inhibidor del inflamasoma (MM01) como herramienta química para estudiar el papel del inflamasoma en modelos de inflamación y cáncer. El capítulo I incluye una descripción general del sistema inmune, los inflamasomas dependientes de ASC y el papel que juegan en el desarrollo de enfermedades. También se profundiza en el papel de los inflamasomas y de la proteína ASC en la progresión del cáncer de mama. Además, se incluyen conceptos básicos de nanotecnología, nanomedicina y polímeros terapéuticos. Finalmente, se abordan las ventajas de utilizar nanomedicinas como terapia, las interacciones de las nanomedicinas con los sistemas biológicos, los nanofármacos descritos en la literatura, así como sus posibilidades de traslación a la práctica clínica. En los capítulos de resultados, delineamos un novedoso mecanismo de acción para MM01, un modulador de la actividad del inflamasoma recientemente identificado: la inhibición de la oligomerización del ASC y el subsiguiente procesamiento reducido de la pro-caspasa-1 y la inhibición de la actividad de la caspasa-1. Demostramos que MM01 interrumpe el proceso de oligomerización de ASC asociado a la actividad de varios inflamasomas e inhibe la liberación de IL-1ß y la piroptosis en varios modelos celulares de inflamación. MM01 también reduce la infiltración de neutrófilos y la acumulación de citoquinas pro-inflamatorias en un modelo in vivo de peritonitis. Dada la implicación de la función de ASC en múltiples complejos del inflamasoma, el tratamiento con MM01 puede representar un enfoque terapéutico eficaz para tratar aquellas enfermedades en las que está implicada la activación de múltiples inflamasomas. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, empleamos nuestro inhibidor del inflamasoma, MM01, para estudiar el papel del inflamasoma en la progresión tumoral en diferentes modelos de cáncer de mama tanto in vitro como in vivo. Demostramos que diferentes líneas celulares de cáncer de mama responden de forma diferente al tratamiento con MM01. Desarrollamos un ensayo funcional que comprende la evaluación de la migración de las células de cáncer de mama en respuesta al secretoma pro-inflamatorio de los macrófagos M1 (estímulo inflamatorio) en presencia de MM01. Ciertas líneas celulares (como la línea celular EO771) mostraron un aumento de la migración en respuesta al estímulo inflamatorio y una disminución de la migración en respuesta al tratamiento con MM01; sin embargo, también identificamos líneas celulares que responden negativamente al tratamiento con MM01 (como la línea celular 4T1). Por último, demostramos la eficacia de este experimento funcional in vivo demostrando que el tratamiento con MM01 redujo el tamaño del tumor en el modelo ortotópico EO771 pero aumentó el tamaño del tumor y la metástasis pulmonar en el modelo ortotópico 4T1. Estos dos modelos, que recapitulan respuestas contradictorias al tratamiento con nuestro inhibidor del inflamasoma, podrán utilizarse en el futuro para determinar biomarcadores que predigan la respuesta. Por último, desarrollamos una estrategia sintética para obtener un nuevo nanomedicamento que mejora la solubilidad y la orientación tumoral del MM01 en un modelo de cáncer de mama. Implementamos un enfoque híbrido de conjugación-complejación que comprende la conjugación de ß-ciclodextrina con un ácido lineal poli-L-glutámico (PGA) (L-PGA-ßCD) para proporcionar la capacidad de atrapar MM01 dentro de los anillos de ciclodextrina. El nanosistema obtenido mostró una mejor solubilidad en soluciones acuosas en comparación con la forma libre de MM01. Nuestro nanosistema demostró una mejor eficacia en un modelo ortotópico de cáncer de mama al producir una mayor reducción del tamaño del tumor en aquellos ratones tratados con la nanomedicina L-PGA-CD-MM01.[CA] Aquesta tesi doctoral titulada "El microambient tumoral inflamatori com a objectiu en el disseny de nanoconjugats per al tractament del càncer de mama avançat" se centra en l'avaluació d'un nou inhibidor del inflamasoma (MM01) com a eina química per a estudiar el paper del inflamasoma en models d'inflamació i càncer. El capítol I inclou una descripció general del sistema immune, els inflamasomas dependents de ASC i el paper que juguen en el desenvolupament de malalties. També s'aprofundeix en el paper dels inflamasomas i de la proteïna ASC en la progressió del càncer de mama. A més, s'inclouen conceptes bàsics de nanotecnologia, nanomedicina i polímers terapèutics. Finalment, s'aborden els avantatges d'utilitzar *nanomedicinas com a teràpia, les interaccions de les nanomedicines amb els sistemes biològics, els nanofármacs descrits en la literatura, així com les seues possibilitats de translació a la pràctica clínica. En els capítols de resultats, delineem un nou mecanisme d'acció per a MM01, un modulador de l'activitat del s*inflamasoma recentment identificat: la inhibició de la oligomerización del ASC i el subsegüent processament reduït de la pro-caspasa-1 i la inhibició de l'activitat de la caspasa-1. Vam demostrar que MM01 interromp el procés de oligomerización de ASC associat a l'activitat de diversos inflamasomas i inhibeix l'alliberament de IL-*1ß i la piroptosis en diversos models cel·lulars d'inflamació. MM01 també redueix la infiltració de neutròfils i l'acumulació de citocines pro-inflamatòries en un model in vivo de peritonitis. Donada la implicació de la funció de ASC en múltiples complexos del *inflamasoma, el tractament amb MM01 pot representar un enfocament terapèutic eficaç per a tractar aquelles malalties en les quals està implicada l'activació de múltiples *inflamasomas. Tenint en compte els resultats obtinguts, emprem el nostre inhibidor del *inflamasoma, MM01, per a estudiar el paper del *inflamasoma en la progressió tumoral en diferents models de càncer de mama tant in vitro com in vivo. Vam demostrar que diferents línies cel·lulars de càncer de mama responen de forma diferent del tractament amb MM01. Desenvolupem un assaig funcional que comprén l'avaluació de la migració de les cèl·lules de càncer de mama en resposta al secretoma pro-inflamatori dels macròfags M1 (estímul inflamatori) en presència de MM01. Unes certes línies cel·lulars (com la línia cel·lular EO771) van mostrar un augment de la migració en resposta a l'estímul inflamatori i una disminució de la migració en resposta al tractament amb MM01; no obstant això, també identifiquem línies cel·lulars que responen negativament al tractament amb MM01 (com la línia cel·lular 4T1). Finalment, vam demostrar l'eficàcia d'aquest experiment funcional in vivo demostrant que el tractament amb MM01 va reduir la grandària del tumor en el model ortotòpic EO771 però va augmentar la grandària del tumor i la metàstasi pulmonar en el model ortotòpic 4T1. Aquests dos models, que recapitulen respostes contradictòries al tractament amb el nostre inhibidor del *inflamasoma, podran utilitzar-se en el futur per a determinar biomarcadors que prediguen la resposta. Finalment, desenvolupem una estratègia sintètica per a obtindre un nou nanomedicament que millora la solubilitat i l'orientació tumoral del MM01 en un model de càncer de mama. Implementem un enfocament híbrid de conjugació-complexació que comprén la conjugació de ß-ciclodextrina amb un àcid lineal *poli-L-glutàmic (PGA) (L-PGA-ßCD) per a proporcionar la capacitat d'atrapar MM01 dins dels anells de ciclodextrina. El nanosistema obtingut va mostrar una millor solubilitat en solucions aquoses en comparació amb la forma lliure de MM01. El nostre nanosistema va demostrar una millor eficàcia en un model ortotòpic de càncer de mama en produir una major reducció de la grandària del tumor en aquells ratolins tractats amb la nanomedicina L-PGA-CD-MM01.[EN] This PhD thesis entitled "The inflammatory tumor microenvironment as a target in the design of nanoconjugates for the treatment of advanced breast cancer" focuses on the evaluation of a novel inflammasome inhibitor (MM01) as a chemical tool to study the role of the inflammasome in models of inflammation and cancer. Chapter I includes an overview of the immune system, ASC-dependent inflammasomes and the role they play in disease development. It also delves into the role of inflammasomes and ASC protein in breast cancer progression. In addition, basic concepts of nanotechnology, nanomedicine and therapeutic polymers are included. Finally, the advantages of using nanomedicines as therapeutics, the interactions of nanomedicines with biological systems, the nanodrugs described in the literature, as well as their translation possibilities to clinical practice are discussed. In the results chapters, we delineate a novel mechanism of action for MM01, a recently identified modulator of inflammasome activity: inhibition of ASC oligomerization and subsequent reduced pro-caspase-1 processing and inhibition of caspase-1 activity. We demonstrate that MM01 disrupts the ASC oligomerization process associated with the activity of several inflammasomes and inhibits IL-1ß release and pyroptosis in several cellular models of inflammation. MM01 also reduces neutrophil infiltration and pro-inflammatory cytokine accumulation in an in vivo model of peritonitis. Given the involvement of ASC function in multiple inflammasome complexes, treatment with MM01 may represent an effective therapeutic approach to treat those diseases in which multiple inflammasome activation is involved. Considering the results obtained, we employed our inflammasome inhibitor, MM01, to study the role of the inflammasome in tumor progression in different breast cancer models both in vitro and in vivo. We demonstrate that different breast cancer cell lines respond differently to MM01 treatment. We developed a functional assay involving the assessment of breast cancer cell migration in response to the pro-inflammatory M1 macrophage secretome (inflammasome stimulus) in the presence of MM01. Certain cell lines (such as the EO771 cell line) showed increased migration in response to the inflammatory stimulus and decreased migration in response to MM01 treatment; however, we also identified cell lines that respond negatively to MM01 treatment (such as the 4T1 cell line). Finally, we demonstrated the efficacy of this functional experiment in vivo by showing that MM01 treatment reduced tumor size in the orthotopic EO771 model but increased tumor size and lung metastasis in the orthotopic 4T1 model. These two models, which recapitulate conflicting responses to treatment with our inflammasome inhibitor, may be used in the future to determine biomarkers predictive of response. Finally, we developed a synthetic strategy to obtain a novel nanomedicine that enhances the solubility and tumor targeting of MM01 in a breast cancer model. We implemented a hybrid conjugation-complexation approach comprising the conjugation of ß-cyclodextrin to a linear poly-L-glutamic acid (PGA) (L-PGA-ßCD) to provide the ability to trap MM01 within the cyclodextrin rings. The obtained nanosystem showed improved solubility in aqueous solutions compared to the free form of MM01. Our nanosystem demonstrated improved efficacy in an orthotopic breast cancer model by producing a greater reduction in tumor size in those mice treated with the L-PGA-CD-MM01 nanomedicine.Soriano Teruel, P. (2023). Inflammatory Tumor Microenvironment as target in the design of nanoconjugates for the treatment of advanced breast cancer [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/19249

El Impacto de Inhibidores del Inflamasoma en la Diferenciación de Macrófagos y la Progresión Tumoral

El microambiente tumoral (TME) y, en particular los macrófagos asociados a tumores (TAMs), desempeñan un papel crucial en la progresión y metástasis del cáncer de mama (1). Sin embargo, los mecanismos reguladores endógenos que subyacen a la diferenciación de los TAMs siguen siendo en gran parte desconocidos. Convencionalmente, las subpoblaciones de macrófagos se han descrito como macrófagos clásicamente activados (M1), con propiedades proinflamatorias y tumoricidas, o alternativamente activados (M2), que suprimen la inflamación y hacen que el endotelio sea más susceptible a la invasión y metástasis de células tumorales (2). Sin embargo, la inflamación juega un papel controvertido en la progresión tumoral. A pesar de que los macrófagos M1 se consideran tumoricidas en etapas tempranas del cáncer, diversos estudios han observado que una reducción en la liberación de citoquinas proinflamatorias (como IL-1β) disminuye la progresión tumoral y la metástasis en etapas avanzadas del cáncer de mama (3). Por lo tanto, el desarrollo de tratamientos antitumorales basados en la selección de macrófagos requiere un conocimiento más profundo del desarrollo de macrófagos y la interacción con el tumor. Un reciente estudio estableció que la diferenciación de los macrófagos está controlada por el inflamasoma (4); un complejo macromolecular del sistema inmune innato responsable de la activación de la proteasa procaspasa-1 (PC1). Una vez activado, PC1 procesa las citoquinas pro-IL1-β y -IL-18 liberadas para inducir la inflamación. Hemos identificado un nuevo inhibidor de inflamasoma, QM378, que inhibe el ensamblaje de componentes del inflamasoma y, por lo tanto, previene la liberación de citoquinas proinflamatorias. En este trabajo, hemos empleado este inhibidor como una herramienta para investigar el papel del inflamasoma en la diferenciación de macrófagos y para dilucidar su papel en la migración de células de cáncer de mama.The tumor microenvironment (TME) and, in particular tumor-associated macrophages (TAMs), play a crucial role in breast cancer progression and metastasis (1). However, the endogenous regulatory mechanisms underlying TAM differentiation remain largely unknown. Conventionally, macrophage subpopulations have been described as either classically activated (M1), possessing proinflammatory and tumoricidal capabilities, or alternatively activated (M2), that suppress inflammation and make the endothelium more susceptible to tumor cell invasion and metastasis (2). However, inflammation has controversial roles in tumor progression. Despite the fact that M1 macrophages are considered tumoricidal in early stages, studies have observed that a reduction in the release of pro-inflammatory cytokines (such as IL-1β) decreases tumor progression and metastasis in advanced stages of breast cancer (3). Thus, the development of antitumoral treatments based on macrophage targeting, requires a deeper knowledge of macrophage development and tumor interaction. A recent study established that macrophage differentiation is controlled by the inflammasome (4); a macromolecular complex of the innate immune system responsible for the activation of the protease procaspase-1 (PC1). Once activated, PC1 processes the pro-IL1-β and -IL-18 cytokines released to induce inflammation. We have identified a new inflammasome inhibitor, QM378 that inhibits inflammasome assembly, thereby preventing release of pro-inflammatory cytokines. Herein, we have employed this inhibitor as a chemical tool to investigate the role of the inflammasome in macrophage differentiation and to elucidate its role in breast cancer cell migration.Soriano Teruel, P. (2018). El Impacto de Inhibidores del Inflamasoma en la Diferenciación de Macrófagos y la Progresión Tumoral. http://hdl.handle.net/10251/115962TFG