Absence of the non-signalling chemerin receptor CCRL2 exacerbates acute inflammatory responses in vivo

Chemerin is a chemotactic protein that induces migration of several immune cells including macrophages, immature dendritic cells, and NK cells. Chemerin binds to three G protein-coupled receptors (GPCRs), including CCRL2. The exact function of CCRL2 remains unclear. CCRL2 expression is rapidly upregulated during inflammation, but it lacks the intracellular DRYLAIV motif required for classical GPCR downstream signalling pathways, and it has not been reported to internalise chemerin upon binding. The aim of this study was to investigate what role if any CCRL2 plays during acute inflammation. Using the zymosan- and thioglycollate-induced murine models of acute inflammation, we report that mice deficient in the Ccrl2 gene display exaggerated local and systemic inflammatory responses, characterised by increased myeloid cell recruitment. This amplified myeloid cell recruitment was associated with increased chemerin and CXCL1 levels. Furthermore, we report that the inflammatory phenotype observed in these mice is dependent upon elevated levels of endogenous chemerin. Antibody neutralisation of chemerin activity in Ccrl2−/− mice abrogated the amplified inflammatory responses. Importantly, chemerin did not directly recruit myeloid cells but rather increased the production of other chemotactic proteins such as CXCL1. Administration of recombinant chemerin to wild-type mice before inflammatory challenge recapitulated the increased myeloid cell recruitment and inflammatory mediator production observed in Ccrl2−/− mice. We have demonstrated that the absence of CCRL2 results in increased levels of local and systemic chemerin levels and exacerbated inflammatory responses during acute inflammatory challenge. These results further highlight the importance of chemerin as a therapeutic target in inflammatory diseases

The role of chemerin and chemerin receptors during acute inflammation

Cytokines play a major role in orchestrating the inflammatory process. This thesis focuses on one such cytokine, called chemerin. Chemerin is a multifunctional protein that is secreted as an inactive precursor, prochemerin, which becomes proteolytically cleaved at the C-terminus into the active signalling molecule, chemerin. Chemerin binds three G-protein coupled receptors: ChemR23, GPR1 and CCRL2, and acts as a chemoattractant, primarily via the ChemR23 receptor expressed on immature dendritic cells, natural killer cells and macrophages. The role of chemerin during inflammation remains controversial. However, multiple studies have reported elevated levels of chemerin in patients suffering from a plethora of inflammatory and metabolic diseases. The need for proteolytic cleavage of chemerin's inactive precursor, prochemerin, results in a myriad of prochemerin-derived isoforms, with varying signalling ability. Current commercially available antibodies are not able to detect different different chemerin isoforms. Therefore, one of the aims of my work was to develop and characterise anti-chemerin antibodies derived from a naive phage display library, which could recognise the inactive sequence of prochemerin and the C-terminus of active chemerin. I set out to investigate the role of chemerin receptors during early stages of inflammation in a well-established model of acute inflammation. Prior to this, I surveyed the protein and mRNA expression of the ChemR23 receptor and the mRNA expression of CCRL2 and GPR1 chemerin receptors on leukocyte subsets. Following this, I investigated the role of the non-signalling chemerin receptor, CCRL2, using an acute inflammatory model of zymosan-induced peritonitis. Mice lacking the CCRL2 receptor displayed augmented inflammatory response compared to age-matched wild type mice. In early time points of this inflammatory model, the CCRL2 knockout mice displayed increased neutrophil and monocyte infiltration to the site of inflammation and augmented mediator production of CXCL1 partly caused by the increased levels of chemerin in the knockout mice. The use of a neutralising chemerin antibody and the pre-treatment of excess recombinant chemerin led me to this conclusion. These pro-inflammatory effects of chemerin were mediated via signalling through the ChemR23 receptor. ChemR23 deficient mice display a reduction in neutrophil and monocyte recruitment to the site of inflammation in the same early time points of zymosan-induced peritonitis. The final aim of this thesis was to investigated the behavioural phenotype of CCRL2 deficient mice after 3 years of working with them. Mice lacking the CCRL2 receptor exhibited increased anxiety behaviour under steady state conditions. Immunohistochemistry of their neuroanatomy showed no differences from age-matched wild type mice. However, wild type in vitro cultured microglia cells express the chemerin receptors. Taken together the results from this thesis illustrate the pro-inflammatory effects of chemerin in early stages of inflammation. Furthermore, the non-signalling chemerin receptor CCRL2 plays a non-redundant role in dampening the effects of chemerin in early stages of inflammation. Further research should be undertaken to elucidate chemerin's role during chronic disease setting of inflammation, in order to suggest whether chemerin could be a beneficial therapeutic target against human disease.</p

Ο ρόλος της πρωτεΐνης χεμερίνη (chemerin) και των υποδοχέων της στην οξεία φλεγμονή

Cytokines play a major role in orchestrating the inflammatory process. This thesis focuses on one such cytokine, called chemerin. Chemerin is a multifunctional protein that is secreted as an inactive precursor, prochemerin, which becomes proteolytically cleaved at the C-terminus into the active signalling molecule, chemerin. Chemerin binds three G-protein coupled receptors: ChemR23, GPR1 and CCRL2, and acts as a chemoattractant, primarily via the ChemR23 receptor expressed on immature dendritic cells, natural killer cells and macrophages. The role of chemerin during inflammation remains controversial. However, multiple studies have reported elevated levels of chemerin in patients suffering from a plethora of inflammatory and metabolic diseases.The need for proteolytic cleavage of chemerin's inactive precursor, prochemerin, results in a myriad of prochemerin-derived isoforms, with varying signalling ability. Current commercially available antibodies are not able to detect different different chemerin isoforms. Therefore, one of the aims of my work was to develop and characterise anti-chemerin antibodies derived from a naive phage display library, which could recognise the inactive sequence of prochemerin and the C-terminus of active chemerin.I set out to investigate the role of chemerin receptors during early stages of inflammation in a well-established model of acute inflammation. Prior to this, I surveyed the protein and mRNA expression of the ChemR23 receptor and the mRNA expression of CCRL2 and GPR1 chemerin receptors on leukocyte subsets. Following this, I investigated the role of the non-signalling chemerin receptor, CCRL2, using an acute inflammatory model of zymosan-induced peritonitis. Mice lacking the CCRL2 receptor displayed augmented inflammatory response compared to age-matched wild type mice. In early time points of this inflammatory model, the CCRL2 knockout mice displayed increased neutrophil and monocyte infiltration to the site of inflammation and augmented mediator production of CXCL1 partly caused by the increased levels of chemerin in the knockout mice. The use of a neutralising chemerin antibody and the pre-treatment of excess recombinant chemerin led me to this conclusion. These pro-inflammatory effects of chemerin were mediated via signalling through the ChemR23 receptor. ChemR23 deficient mice display a reduction in neutrophil and monocyte recruitment to the site of inflammation in the same early time points of zymosan-induced peritonitis.The final aim of this thesis was to investigated the behavioural phenotype of CCRL2 deficient mice after 3 years of working with them. Mice lacking the CCRL2 receptor exhibited increased anxiety behaviour under steady state conditions. Immunohistochemistry of their neuroanatomy showed no differences from age-matched wild type mice. However, wild type in vitro cultured microglia cells express the chemerin receptors.Taken together the results from this thesis illustrate the pro-inflammatory effects of chemerin in early stages of inflammation. Furthermore, the non-signalling chemerin receptor CCRL2 plays a non-redundant role in dampening the effects of chemerin in early stages of inflammation. Further research should be undertaken to elucidate chemerin's role during chronic disease setting of inflammation, in order to suggest whether chemerin could be a beneficial therapeutic target against human disease.Οι κυτοκίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην ενορχήστρωση της φλεγμονώδους διαδικασίας. Αυτή η διατριβή εστιάζει σε μια τέτοια κυτοκίνη, που ονομάζεται χεμερίνη (chemerin). Η χεμερίνη είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη που εκκρίνεται ως αδρανής πρόδρομος, η προχεμερίνη (prochemerin), η οποία διασπάται πρωτεολυτικά στο C-άκρο και γίνεται ενεργό μόριο σηματοδότησης, δηλαδή χεμερίνη. Η χεμερίνη δεσμεύει τρεις υποδοχείς συζευγμένους με G-πρωτεΐνη (G-protein coupled): ChemR23, GPR1 και CCRL2 και δρα ως χημειοκίνη, κυρίως μέσω του υποδοχέα ChemR23 που εκφράζεται σε ανώριμα δενδριτικά κύτταρα, φυσικά φονικά κύτταρα και μακροφάγους. Ο ρόλος της χεμερίνης κατά τη διάρκεια της φλεγμονής παραμένειαμφιλεγόμενος. Ωστόσο, πολλές μελέτες έχουν αναφέρει αυξημένα επίπεδα χεμερίνης σε ασθενείς που πάσχουν από μια πληθώρα φλεγμονωδών και μεταβολικών ασθενειών. Η ανάγκη για πρωτεολυτική διάσπαση του ανενεργού προδρόμου της χεμερίνης, της προχεμερίνης, έχει ως αποτέλεσμα μια μυριάδα ισομορφών που προέρχονται από την προχεμερίνη, με ποικίλες ικανότητες σηματοδότησης. Τα διαθέσιμα αντισώματα που ήδη κυκλοφορούν στην αγορά δεν είναι σε θέση να ανιχνεύσουν τις διαφορετικές παραλλαγές της χεμερίνης. Ως εκ τούτου, ένας από τους στόχους της δουλειάς μου ήταν να αναπτύξω και να χαρακτηρίσω αντισώματα αντι-χεμερίνης που προέρχονται από μια βιβλιοθήκη απλοϊκής παρουσίασης φάγων (naivephagedisplaylibrary), η οποία θα μπορούσε να αναγνωρίσει την ανενεργή αλληλουχία της προχεμερίνης και το C-άκρο της ενεργής χεμερίνης.Ξεκίνησα διερευνώντας το ρόλο των υποδοχέων της χεμερίνης κατά τα πρώιμα στάδια της φλεγμονής σε ένα καλά εδραιωμένο μοντέλο οξείας φλεγμονής. Πριν από αυτό, ερεύνησα την έκφραση πρωτεΐνης και το mRNA του υποδοχέα ChemR23 και την έκφραση mRNA των υποδοχέων χεμερίνης CCRL2 και GPR1 σε υποσύνολα λευκοκυττάρων. Κατόπιν , διερεύνησα τον ρόλο του μη σηματοδοτούμενου υποδοχέα chemerin, CCRL2, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο οξείας φλεγμονής περιτονίτιδας που προκαλείται από ζυμοζάνη (zymosan). Τα ποντίκια που δεν είχαν τον υποδοχέα CCRL2 εμφάνισαν αυξημένη φλεγμονώδη απόκριση σε σύγκριση με ποντίκια άγριου τύπου (wildtype) της ίδιας ηλικίας. Σε πρώιμα χρονικά σημεία αυτού του φλεγμονώδους μοντέλου (αρχικά στάδια της φλεγμονής του μοντέλου), τα ποντίκια που δεν εξέφραζαν το CCRL2 (knockout) εμφάνισαν αυξημένη διήθηση ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων στο σημείο της φλεγμονής και αυξημένη παραγωγή μεσολαβητή του CXCL1 που προκλήθηκε εν μέρει από τα αυξημένα επίπεδα χεμερίνης στα ποντίκια νοκ-άουτ (KnockoutCCRL2). Η χρήση ενός εξουδετερωτικού αντισώματος χεμερίνης και η προεπεξεργασία περίσσειας χεμερίνης με οδήγησαν σε αυτό το συμπέρασμα. Αυτές οι προ-φλεγμονώδεις επιδράσεις της χεμερίνης έλαβαν χώραν μέσω σηματοδότησης προς τον υποδοχέα ChemR23. Τα ποντίκια με έλλειψη ChemR23 εμφανίζουν μείωση της στρατολόγησης ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων στο σημείο της φλεγμονής στα ίδια πρώιμα χρονικά σημεία της περιτονίτιδας που προκαλείται από τη ζυμοζάνη.Ο τελικός στόχος αυτής της διατριβής ήταν η διερεύνηση του φαινοτύπου συμπεριφοράς ποντικών με έλλειψη CCRL2 μετά από 3 χρόνια εργασίας μαζί τους. Τα ποντίκια που δεν είχαν τον υποδοχέα CCRL2 εμφάνισαν αυξημένη συμπεριφορά άγχους υπό συνθήκες σταθερής κατάστασης. Η ανοσοϊστοχημεία της νευροανατομίας τους δεν έδειξε διαφορές σε σχέση με ποντίκια άγριου τύπου της ίδιας ηλικίας. Ωστόσο, μικρογλοιακά κύτταρα άγριου τύπου καλλιεργημένα in vitro, εκφράζουν τους υποδοχείς της χεμερίνης.Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτής της διατριβής απεικονίζουν τις προφλεγμονώδεις επιδράσεις της chemerin στα αρχικά στάδια της φλεγμονής. Επιπλέον, ο μη σηματοδοτικός υποδοχέας χεμερίνης CCRL2 παίζει έναν μη περιττό ρόλο στην άμβλυνση των επιδράσεων της χεμερίνης στα αρχικά στάδια της φλεγμονής. Θα πρέπει να διεξαχθεί περαιτέρω έρευνα για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος της χεμερίνης κατά τη διάρκεια της φλεγμονής σε χρόνιες ασθένειες, προκειμένου να αποδειχθεί εάν η χεμερίνη θα μπορούσε να έχει θεραπευτικές ιδιότητες στις ανθρώπινες νόσους

The Role of Metabolite-sensing G Protein-Coupled Receptors in inflammation and metabolic disease

Significance: Great attention has been placed on the link between metabolism and immune function giving rise to the term “immunometabolism.” It is widely accepted that inflammation and oxidative stress are key processes that underlie metabolic complications during obesity, diabetes, and atherosclerosis. Therefore, identifying the mechanisms and mediators that are involved in the regulation of both inflammation and metabolic homeostasis is of high scientific and therapeutic interest. Recent Advances: G protein-coupled receptors (GPCRs) that signal in response to metabolites have emerged as attractive therapeutic targets in inflammatory disease. Critical Issues and Future Directions: In this review, we discuss recent findings about the physiological role of the main metabolite-sensing GPCRs, their implication in immunometabolic disorders, their principal endogenous and synthetic ligands, and their potential as drug targets in inflammation and metabolic disease