Evaluation of effects caused by differentially spliced Ets-1 transcripts in fibroblasts

The transcription factor Ets-1 is known to be involved in a broad variety of cellular functions such as cell proliferation, migration, invasion, apoptosis and angiogenesis. In nearly all these reports, the full-length Ets-1 (p51) is commonly considered to be the active form and the role of the Ets-1?VII splice variant (p42) has not been addressed. Therefore, we studied the functional effects of p42 Ets-1 in comparison to p51 Ets-1 expression in a well-characterized mouse fibroblast cell line. Furthermore, the specific role of Ets-1 was evaluated using mouse fibroblasts with a reduced Ets-1 expression caused by RNAi and compared to fibroblasts with a binding inhibition of the whole ETS transcription factor family by stably overexpressing the ETS DNA binding domain as transdominant-negative mutant. Our results demonstrate that p42 Ets-1 has quite different functions and target genes compared to p51 Ets-1 (e.g. TIMP-4, MMP-3, MMP-9, MMP-13). In some cases (e.g. in cytokine expression) p42 Ets-1 is a functional transcription factor which acts in the same manner as a transdominant-negative approach

A Functional γδTCR/CD3 Complex Distinct from γδT Cells Is Expressed by Human Eosinophils

BACKGROUND:Eosinophils are effector cells during parasitic infections and allergic responses. However, their contribution to innate immunity has been only recently unravelled. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS:Here we show that human eosinophils express CD3 and gammadelta T Cell Receptor (TCR) but not alphabeta TCR. Surface expression of gammadeltaTCR/CD3 is heterogeneous between eosinophil donors and inducible by mycobacterial ligands. Surface immunoprecipitation revealed expression of the full gammadeltaTCR/CD3 complex. Real-time PCR amplification for CD3, gamma and delta TCR constant regions transcripts showed a significantly lower expression in eosinophils than in gammadeltaT cells. Limited TCR rearrangements occur in eosinophils as shown by spectratyping analysis of CDR3 length profiles and in situ hybridization. Release by eosinophils of Reactive Oxygen Species, granule proteins, Eosinophil Peroxidase and Eosinophil-Derived Neurotoxin and cytokines (IFN-gamma and TNF-alpha) was observed following activation by gammadeltaTCR-specific agonists or by mycobacteria. These effects were inhibited by anti-gammadeltaTCR blocking antibodies and antagonists. Moreover, gammadeltaTCR/CD3 was involved in eosinophil cytotoxicity against tumor cells. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE:Our results provide evidence that human eosinophils express a functional gammadeltaTCR/CD3 with similar, but not identical, characteristics to gammadeltaTCR from gammadeltaT cells. We propose that this receptor contributes to eosinophil innate responses against mycobacteria and tumors and may represent an additional link between lymphoid and myeloid lineages

VE-statin/egfl7 Expression in Endothelial Cells Is Regulated by a Distal Enhancer and a Proximal Promoter under the Direct Control of Erg and GATA-2

Angiogenesis is the process by which new blood vessels arise from existing ones by the budding out of endothelial cell capillaries from the luminal side of blood vessels. Blood vessel formation is essential for organ development during embryogenesis and is associated with several physiological and pathological processes, such as wound healing and tumor development. The VE-statin/egfl7 gene is specifically expressed in endothelial cells during embryonic development and in the adult. We studied here the regulatory mechanisms that control this tissue-specific expression. RT-qPCR analyses showed that the specificity of expression of VE-statin/egfl7 in endothelial cells is not shared with its closest neighbor genes notch1 and agpat2 on the mouse chromosome 2. Chromatin-immunoprecipitation analysis of histone modifications at the VE-statin/egfl7 locus showed that the chromatin is specifically opened in endothelial cells, but not in fibroblasts at the transcription start sites. A 13 kb genomic fragment of promoter was cloned and analyzed by gene reporter assays which showed that two conserved regions are important for the specific expression of VE-statin/egfl7 in endothelial cells; a −8409/−7563 enhancer and the −252/+38 region encompassing the exon-1b transcription start site. The latter contains essential GATA and ETS-binding sites, as assessed by linker-scanning analysis and site-directed mutagenesis. An analysis of expression of the ETS and GATA transcription factors showed that Erg, Fli-1 and GATA-2 are the most highly expressed factors in endothelial cells. Erg and GATA-2 directly control the expression of the endogenous VE-statin/egfl7 while Fli-1 probably exerts an indirect control, as assessed by RNA interference and chromatin immunoprecipitation. This first detailed analysis of the mechanisms that govern the expression of the VE-statin/egfl7 gene in endothelial cells pinpoints the specific importance of ETS and GATA factors in the specific regulation of genes in this cell lineage

Etude du rôle et de l'expression de la VE-statine (egfl7)

Notre équipe a récemment découvert le gène VE-statine (ou egfl7) et montré qu'il s'exprime spécifiquement dans les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins embryonnaires. Ce gène code pour une protéine sécrétée de 30 kDa : la VE-statine ou Vascular Endothelial-statin', qui a peu d'homologie de structure avec d'autres protéines connues, excepté deux domaines Epidermal Growth Factor' (EGF) et un domaine Emilin (EMI). In vitro, la VE-statine est capable d'inhiber la migration des cellules musculaires lisses induite par le PDGF-BB. In vivo, la diminution d'expression d'egfl7 chez le poisson zèbre (danio rerio) provoque des anomalies vasculaires et perturbe la tubulogenèse, avec pour conséquence l'absence de circulation sanguine. Le rôle physiologique de la protéine et ses mécanismes d'action sont encore très peu connus. Afin d'évaluer le rôle de la VE-statine chez l'adulte, nous avons étudié son patron d'expression dans diverses situations normales ou pathologiques, par hybridation in situ et RT-PCR quantitative en temsp réel. L'expression de ce gène est ainsi retrouvée dans tous les tissus adultes analysés et, comme chez l'embryon, exclusivement au niveau des cellules endothéliales. Nous avons mis en évidence une répression de l'expression du gène par les cytokines pro-inflammatoires IL1- , IL1- et TNF- dans les cellules endothéliales. Cet effet implique le facteur NF- B et fait intervenir des phénomènes épigénétiques de régulation de l'acétylation des histones. Nous avons d'autre part cloné l'ADNc de la VE-statine dans un vecteur d'expression et mis au point la production et la purification de la protéine recombinante afin d'étudier la réponse des cellules musculaires lisses aortiques à la stimulation par la VE-statine. Enfin, la recherche de gènes cibles régulés par la VE-statine dans les cellules musculaires lisses stimulées par le PDGF-BB est en cours d'une approche de puces à ADN.VE-statine (or egfl7) is a novel gene recently discovered by our team which is specifically expressed by endothelial cells of embryonic blood vessels. The gene codes for a 30kDa secreted protein, VE-statin (Vascular Endothelial-statin), which shares no clear structural homology with other known proteins, except for two Epidermal Growth Factor (EGF) domains and an Emilin (EMI) domain. In vitro, VE-statin inhibits PDGF-BB-induced smooth muscle cell migration. In vivo, egfl7 knockdown in the zebrafishinduces major vascular defects, with a defective tubulogenesis and a lack of blood flow. Despite these results, the physiological role of the protein and its mechanisms of action remain largely unknown. We have studied the VE-statin expression pattern in various normal and pathological situations in adults using in situ hybridization and real-time quantitative RT-PCR. We have shown that VE-statin is expressed in all tissues analysed, and like in the embryo, exclusively in endothelial cells. Moreover, expression of the gene is down-regulated by pro-inflammatory cytokines IL1- , IL1- and TNF- . The NF- B nuclear factor is involved in this effect, as well as epigenetic machanisms, especially those involving the regulation of histone acetylation. In addition, we have cloned the VE-statin cDNA in an expression vector and designed a protocol for the production and purification of the mouse recombinant protein, with the aim of studying aortic smooth muscle cell response to VE-statin. Finally, we have initiated a micro-array analysis in order to identify VE-statin regulated genes in smooth muscle cells.LILLE2-BU Santé-Recherche (593502101) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Etude des gènes cibles du facteur de transcription Ets 1 dans les cellules endothéliales

LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF

Etude de la régulation transcriptionnelle du gène VE-statine/egfl7 dans les cellules endothéliales au cours de l'angiogenèse

Le gène de la VE-statine/egfl7 est spécifiquement exprimé dans les cellules endothéliales très tôt au cours du développement et tout au long de la vie embryonnaire. Mon projet principal a consisté à analyser son promoteur afin d'identifier les régions et les mécanismes de régulation responsables de son expression spécifique dans les cellules endothéliales. Un fragment de 13kb du promoteur du gène murin a été isolé et sous-cloné et l'analyse in vitro de l'activité transcriptionnelle de fragments de ce promoteur par découpage progressif a permis de mettre en évidence le rôle combiné d'un promoteur proximal et de deux régions régulatrices; la région I et la région II nécessaires pour une forte expression du gène dans les cellules endothéliales. La région I agit comme un enhancer de la transcription dans les cellules endothéliales bien qu'aucun site spécifique ne soit essentiel pour l'activité de cette région. Il semble que l'ensemble de cette zone soit importante pour l'expression du gène. En revanche, l'analyse du promoteur proximal par découpage et par mutagénèse a permis d'identifier un site EBS qui est fondamental pour l'activité du promoteur. Nous avons étudié l'expression du gène en réponse à des inhibiteurs d'histones deacétylases, de méthylation des histones ou de méthylation de l'ADN et montré que l'expression de la VE-statine/egfl7 est inversement régulée par ces inhibiteurs respectivement dans les cellules endothéliales et non endothéliales. Nous avons mis au point la technique d'immuno-précipitation de la chromatine (ChIP) quantitative afin d'identifier les modifications d'acétylation et de méthylation des histones H3 et H4 sur l'ensemble du gène. Les fibroblastes et les cellules endothéliales présentent des profils d'acétylation et de méthylation des histones différents le long de la région promotrice du gène VE-statine/egfl7 et la chromatine est majoritairement décondensée dans les cellules endothéliales alors qu'elle est condensée dans les fibroblastes. Dans les cellules endothéliales, l'enhancer est situé à la limite d'une zone de chromatine décondensée dans sa région 5' et de chromatine condensée en 3'. La chromatine retrouve une forme décondensée au niveau du promoteur minimal uniquement dans les cellules endothéliales. En parallèle, nous avons réalisé des expériences de transgénèse chez la souris avec un premier fragment de promoteur comportant l'ensemble des régions régulatrices placé dans un vecteur rapporteur. L'analyse des embryons obtenus a montré que ces régions orientent préférentiellement l'expression de la ß-galactosidase (LacZ) dans les cellules endothéliales. Nous avons créé d'autres vecteurs de transgénèse en retirant progressivement les régions identifiées au cours de l'analyse in vitro. La comparaison du marquage des embryons obtenus lors de l'injection des différentes constructions a permis d'évaluer celles qui sont capables de récapituler au mieux l'expression endogène du gène lors du développement. Ainsi, le fragment le plus court, qui correspond au promoteur minimal, permet déjà une expression préférentielle de la b-galactosidase dans certaines cellules endothéliales de l'embryon. L'ensemble de nos résultats suggère donc que l'expression spécifique des cellules endothéliales du gène VE-statine/egfl7 serait due à la fois à l'activité de régions activatrices localisées en 5' du gène et à un ensemble de régulations épigénétiques. Une autre partie de nos travaux sur la régulation des gènes dans les cellules endothéliales a consisté à finaliser une étude réalisée sur le promoteur du gène de la VE-cadhérine. Nous avons montré que ce gène est régulé par le facteur de l'hypoxie HIF-2a mais pas par HIF-1a et mis en évidence une coopération positive entre les facteurs Ets1 et HIF-2a dans la régulation de ce gène (Le Bras et al. Oncogene 2007)LILLE2-BU Santé-Recherche (593502101) / SudocSudocFranceF

Molecular Mechanisms of AngiogenesisFrom Ontogenesis to Oncogenesis /

XI, 505 p. 64 illus., 58 illus. in color.online r

Les gènes qui font l'identité endothéliale

L'endothélium forme un tissu qui possède une identité propre due à l'expression spécifique de marqueurs moléculaires par les cellules endothéliales. L'endothélium présente d'autre part une hétérogénéité de structure qui est illustrée par l'expression de marqueurs spécifiques des artères ou des veines. Nous présentons ici une revue des mécanismes de régulation transcriptionnelle et épigénétique des principaux marqueurs des cellules endothéliales chez l'Homme et la souris qui démontre qu'il n'existe pas de mécanisme commun et unique d'expression spécifique de gènes dans ces cellules