Identification of Ligand-Receptor Interactions Between Saccharomyces cerevisiae α-factor Pheromone Receptor (Ste2p) and its Tridecapeptide Ligand

G protein-coupled receptors (GPCRs) are a class of integral membrane receptor proteins that are characterized by a signature seven-transmembrane (7TM) configuration. These receptors comprise a large and diverse gene family found in fungi, plants, and the animal kingdom. Recent studies with GPCRs have begun to elucidate their importance in many physiological processes, thus various human diseases are associated with GPCR pathology. Although the overall 3D structure of these receptors carry similar features, binding of an extraordinarily diverse array of ligands trigger many different biological pathways. The α-factor receptor (Ste2p) of Saccharomyces cerevisiae belongs to the GPCR family. Upon the α-factor binding to Ste2p, a signal is transduced via an associated guanine-nucleotide binding protein initiating a cascade of events that leads to the mating of haploid yeast cells. As only two GPCRs and two G proteins are encoded in the S. cerevisiae genome, this yeast presents a relatively simple system to study GPCR signal transduction in comparison to mammalian cells that possess hundreds of GPCRs and tens of G proteins. Part I of this dissertation is an overview of GPCRs in general with specific emphasis on the peptide pheromone α-factor and its receptorSte2p. Part II of this dissertation details the design and characterization of a number ofiodinatable α-factor pheromone analogs containing the photo-cross-linkable 4-benzoyl-Lphenylalanine (Bpa) group. One of these analogs [Bpa1, Y3, R7, Nle12, F13] was radioiodinated for detection and used as a probe for cross-linking studies with Ste2p. Chemical (with CNBr & BNPS-skatole) and enzymatic (with Trypsin) cleavage of the receptor/analog complex after the cross-linking was examined to determine the interaction between the α-factor probe and a fragment of the receptor. Data from these digestions indicated that the position one of the α-factor interacts with residues 251 to 294 in the receptor. Similarly Part III of this dissertation describes the design and synthesis of five photoactivatable α-factor analogs that carry Bpa at positions one, three, five, eight, or thirteen. All of these analogs were biotinylated at the ε-amine of the Lys7 for detection and purification purposes. The biological activity (growth arrest assay) and binding affinities of all analogs for Ste2p were determined. Two of the analogs tested, Bpa1 and Bpa5, showed three- to four-fold lower affinity compared to α-factor, whereas Bpa3 and Bpa13 had seven- to twelve-fold lower affinities, respectively. Bpa8 competed poorly with [3H]α-factor for Ste2p. All of the analogs tested had detectable halos in the growth arrest assay indicating that these analogs are α-factor agonists. Cross-linking studies demonstrated that [Bpa1]α-factor, [Bpa3]α-factor, [Bpa5]α-factor and [Bpa13]α-factor were cross-linked to Ste2p; the biotin tag on the pheromone was detected by a NeutrAvidin-HRP conjugate on Western blots. Digestion of Bpa1, Bpa3, and Bpa13 cross-linked receptors with chemical and enzymatic reagents suggested that the N-terminus of the pheromone interacts with a binding domain consisting of residues from the extracellular ends of TM5, TM6, and TM7 and portions of EL2 and EL3 close to these TMs. Additionally it was concluded that there is a direct interaction between the position 13 side chain and a region of Ste2p (F55-R58) at the extracellular end of TM1. Parts II and III of this dissertation indicate that Bpa-containing α-factor probes are useful in determining contacts between α-factor and Ste2p and initiating mapping of the ligand binding site of the GPCR for its peptide ligand. This dissertation (Part IV) also presents the application of different purification methods and the use of two mass spectrometry instruments for identification of ligandreceptor interactions at the molecular level. Results presented in this part showed that although a single step purification was enough for western blot analyses of the cross-linked receptor fragments, at least a two-step purification and enrichment of the biotinylated peptide fragments were necessary for mass spectrometric studies. MALDITOF experiments showed that the affinity purification of the biotinylated fragments by monomeric avidin beads was successful. Data obtained from CNBr fragments of Bpa1 cross-linked membranes were in agreement with the previous results discussed in Parts II and III of this dissertation suggesting the cross-linking between position one of α-factor and a region of Ste2p covering residues 251 to 294. This part also illustrated that the analyses of the MS/MS data from the cross-linked fragments were more complex than the fragmentation data obtained from biotinylated α-factor; the presence of multiple charge states of fragment ions and unusual fragmentation of branched peptides indicated the necessity of using an instrument with higher resolution. In addition, analyses of the MS/MS data with a customized algorithm would be required to deconvolute the sequence of the cross-linked fragment(s) to identify the cross-linked residue(s) on Ste2p. The final part of this dissertation reviews the overall conclusions and discussion. This part also contains suggestions for future experiments that could help identification of contact points between Ste2p and its peptide ligand α-factor. Additional studies on this GPCR system employing high-resolution mass spectral characterization of fragments should allow identification of residue-to-residue interactions between the analogs used in this study and Ste2p. Such information will aid the mapping of the ligand-binding site of the pheromone receptor and has the potential to provide key insights into peptide ligand mediated activation of GPCRs. This and similar studies may ultimately lead to the discovery of how peptide ligands initiate signal transduction through GPCRs

G Proteine kenetli reseptörlerin eşleşmesi: yapı-işlev analizi ve moleküler mekanizmalar

TÜBİTAK TBAG Proje01.11.201

Interactions between G-protein Coupled Receptors and Ligand Gated Ion Channels (GPCR-LGIC COUPLING)

Dopamine receptors are members of G-protein coupled receptor superfamily. These receptors are the key point of dopaminergic system, which controls the regulation of memory, attention, food intake, endocrine regulation, psychomotor activity and positive reinforcement. To regulate so many critically important neurological events, dopamine receptors have complex interactions with other receptors and ion channels. In this study, a trimeric complex comprising D2 receptor -which is a subtype of dopamine receptors- , A2A adenosine receptor being another G-protein coupled receptor and a ligand gated ion channel N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor will be investigated. The aim of this project will be the application of a novel technique we refer as SplitGFP-FRET for the first time. For this study, “Fluorescence Resonance Energy Transfer” and “Split GFP” methods will be combined so as to reveal the trimeric D2 dopamine receptor- A2A adenosine receptor-NMDA receptor interactions. With the proposed study, a fluorescence technique to analyze live cell culture will be developed. This model will potentially lead to understanding of molecular mechanisms of many neuropathological conditions like schizophrenia and Parkinson’s disease because these disorders have already been shown to be associated with dysregulations in dopaminergic systems. Therefore, this project aims to reveal detailed links between schizophrenia and interactions of D2 dopamine receptor with other receptors and ion channels. The developed live cell model will also be useful for testing anti-psychotic drugs whether they have effects on disruption of protein-protein interactions, which will, in turn, ease screening of newly designed drugs.EU, Funded under :FP7-PEOPLE-2010-R

Dopamin D2 reseptörlerinin hücre zarındaki etkileşimleri

Bu projede amacımız, bölünmüş yeşil floresan protein (İng. split GFP) ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) gibi günümüzde hızla gelişmekte olan ışık mikroskopu tekniklerini kullanarak sinir sisteminde yer alan ve birer GPKR olan adenozin A2A ve Dopamine D2 reseptörlerinin birbirleriyle veya kendi aralarında eşleşmesinde etkili mekanizmaları daha iyi anlayabilmek, bu eşleşmenin hücre içinde nerede gerçekleştiğini ortaya çıkarmak ve eşleşme sonucunda oluşan reseptör heterodimerlerinin farmakolojik özelliklerini analiz etmektir.Bu projenin sonucunda ise dopamin D2 reseptörlerinin birbirleriyle ve/veya adenozin A2A reseptörleriyle nasıl ve nerede eşleştikleri, bu eşleşmelerin reseptör sentezlenmesi, yapı-işlev ilişkisi ve reseptör farmakolojisi açısından önemleri ile madde bağımlılığı, kalıtsal hastalıklar ve psikiyatrik ilaç kullanımından nasıl etkilendiklerinin moleküler mekanizmaları anlaşılmış olacaktır. Aynı zamanda, literatürdeki birçok çalışmada GPKR’nin eşleşmesi sonucunda farklı sinyal yolaklarını tetiklendiği ispatlanmıştır. Bu projenin başarı ile tamamlanması durumunda, eşleşme sonucunda oluşan yeni sinyal yolağının farmakolojik özelliklerini analiz etmek için yeni çalışmalarımız başlayacaktır

Farmakolojik Önem Taşıyan G-Protene Kenetli Dopamin Reseptörlerinin N-Metil-D-Asparat Reseptörü İle Etkileşiminin Floresan Yöntemlerle Tespiti Ve Bu Etkileşimin Farmakolojik Etkilerinin Araştırılması

GPKRlerin birbirleriyle eşleşmeleri yanısıra diğer zar proteinleriyle eşleşmeleri de işlevsel ve farmakolojik açıdan büyük önem taşımaktadır. GPKRlerin eşleştiği proteinler arasında bazı reseptör tirozin kinazlar ve iyon kanalları gibi hücre fizyolojisinde önemli olan birçok protein vardır. Özellikle sinir siteminde yer alan birçok GPKR’nin birbirleriyle ve iyon kanallarıyla etkileşim içinde oldukları bilinmektedir. Bu etkileşimin en açık örnekleri D5 dopamin reseptörü – γ-aminobütirik asit (GABA) reseptörü etkileşimi ve D1 dopamin reseptörü – N-metil-D-asetat (NMDA) reseptörü etkileşimleridir. Bu reseptör ikilileri hormonal sistem ve sinir sisteminin birleşme noktası olarak da görülebilir. Bu projede amacımız, bölünmüş yeşil floresan protein (İng. split GFP) ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) gibi günümüzde hızla gelişmekte olan ışık mikroskopu tekniklerini kullanarak sinir sisteminde yer alan bir GPKR olan D1 ve D2 dopamin reseptörleri ile aynı zamanda bir iyon kanalı olan N-metil D-aspartat (NMDA) reseptörlerinin eşleşmesinde etkili mekanizmaları daha iyi anlayabilmek, bu eşleşmenin hücre içinde nerede gerçekleştiğini ortaya çıkarmak ve eşleşme sonucunda oluşan reseptör heterodimerlerinin farmakolojik özelliklerini analiz etmektir. Bu amaca ulaşabilmek için planımız bir nöroblastoma hücre hattı (N2a) kullanarak hücre kültüründe NMDA reseptörünü ve dopamin reseptörlerini yeşil floresan protein (GFP) varyantları ve bölünmüş EGFP parçaları ile işaretlemek ve konfokal mikroskopi yöntemleri kullanarak bu proteinlerin canlı hücrelerde nerede ve nasıl eşleştiklerini gerçek zamanlı olarak tespit etmek (Hedef II), son olarak bu yöntemler kullanılarak eşleştikleri tespit edilen reseptörlerin eşleşmeden yoksun reseptörler ile farmakolojik olarak karşılaştırılmasını (Hedef III) yapmaktır

Protein-Protein Interactions in Live Cells: Reinventing the Wheel

G protein-coupled receptors (GPCRs) are membrane proteins that mediate physiologicalresponse to a diverse array of stimuli. In humans, they mediate the action of hundreds ofpeptide hormones, sensory stimuli, odorants, neurotransmitters, and chemokines. GPCRs alsoare targets for ~40% of all currently marketed pharmaceuticals. These receptors traditionallybeen thought to act as monomeric units. However, recent evidence suggests that GPCRs mayform dimers as part of their normal trafficking and function. While the formation of GPCRdimers/oligomers have been reported to play important roles in regulating receptorexpression, ligand binding, and second messenger activation, less is known about how GPCRdimers interact with other proteins such as G-proteins and Arrestin.We are interested in studiying the interactions between GPCRs and effect of this dimerizationon G-protein dimerization. Our group also focus on the mechanisms of receptor-arrestinbinding in live cells using Föster resonance energy transfer (FRET) and bimolecularfluorescence complementation (BiFC) assays. We designed and developed tagged receptors,G-proteins and Arrestin proteins using Green florescent protein variants that can be used inimaging studies. These constructs are suitable for testing drug candidates and/or analyzeprotein-protein interfaces for GPCRs or G-protein dimers

Biyolojik Floresan Komplemantasyon Tekniğinin Protein Etkileşimlerinde Kullanılması Ve Zar Proteinlerine Uygulanması

Proje kapsamında kullanılması öngörülen floresan tekniklerin başında temelleri 1990’lı yıllara dayanan ve prensipte bir bölünmüş protein komplemantasyon tekniği (PCA, İng. protein- fragment complementation assay) olan bölünmüş yeşil protein (İng. Split-GFP) gelmektedir. Biyolojik floresan komplemantasyon (BiFC, İng. biomolecular fluorescence complementation) tekniği olarak da literatürde tanımlanan bölünmüş-GFP tekniği 238 amino asitlik yeşil floresan proteinin floresan özellik göstermeyen iki parçaya ayrılması ve bu parçaların birbirleri ile etkileştikleri test edilen proteinlere klonlama yöntemi ile eklenmesi yolu ile yapılır. Test edilen proteinlerin birbirleri ile etkileşmeleri durumunda yeşil floresan parçaları birleşerek floresan işlevini geri kazanırlar, bu sayede test edilen proteinlerin etkileştikleri bilgisinin yanısıra bu etkileşimin hücre içinde nerede ve ne şartlar altında gerçekleştiği bilgisi gerçek zamanlı olarak test edilebilir. Önerilen bu projede amacımız: Bölünmüş yeşil protein tekniğini kullanarak maya hücrelerinde zar proteinlerinin birbirleri ile etkileşimlerini incelemek ve özellikle GPCR eşleşmlerini çalışmak için görüntüleme tekniklerini optimize etmektir. Bu floresan tekniğin GPCRlere ve maya hücrelerine uyarlanması sırasında edinelecek deneyimler ilerleyen yıllarda gerçekleştirmeyi planladığımız projelerde transkripsiyon sonrası reseptörlerde gerçekleşen glikozilasyon ve fosforilasyonun, reseptör eşleşmesine olan etkilerinin araştırılmasının yanısıra çalışılacak diğer GPCRlerin bu tekniklerle incelenmesini mümkün kılacaktır. Proje sonucunda geliştireceğimiz floresan tekniklerin ve elde edeceğimiz sonuçların, ileriki çalışmalarda birçok GPCRnin eşleşmelerini, bu eşleşmelerin yapı-işlev ilişkilerini ve eşleşme için gerekli olan moleküler mekanizmaları anlamak için yararlı olacağını düşünüyoruz