Efeito da desnutrição protéica experimental na hemopoese medular

A desnutrição protéico-energética (DPE) é a forma de desnutrição mais encontrada em áreas subdesenvolvidas, atingindo principalmente recém-nascidos de baixo peso para sua idade gestacional, pacientes hospitalizados sob alimentação parenteral, idosos, crianças pré-escolares, indivíduos com distúrbios alimentares como na anorexia nervosa e bulimia e pacientes portadores de neoplasias, doenças crônicas e sob quimioterapia. No sistema hematopoético, a proliferação e diferenciação celular ocorrem de forma constante e equilibrada, sensível às demandas de linhagens celulares específicas. O comportamento medular da população de cada linhagem hematopoética é controlado pelo equilíbrio entre auto-renovação das células tronco, a diferenciação e a morte celular. Alterações estruturais e celulares em órgãos hematopoéticos têm sido relatadas na DPE, com redução da celularidade de medula óssea e da sua capacidade de resposta a estímulos inflamatórios e/ou infecciosos em indivíduos desnutridos. Neste trabalho estudamos o efeito da deficiência protéica experimental em diferentes linhagens hematopoéticas, através da realização do hemograma e do mielograma; avaliamos a capacidade proliferativa ex vivo por técnicas imunocitoquímica (detecção de regiões organizadoras de nucléolo marcadas pela prata - AgNOR) e de imunohistoquímica (detecção do antígeno de proliferação nuclear - PCNA) e, em ensaios de cultura líquida e clonogênicos em metilcelulose. Paralelamente, avaliamos o perfil imunofenotípico e estudos morfológicos de células da medula óssea em DPE. Células não-derentes foram cultivadas em meio líquido (CL), avaliando-se durante 1,3 e 5 dias, e células totais foram cultivadas em metilcelulose, avaliando-se durante 7, 14 e 21 dias, em ambos os ensaios, a proliferação celular em hemocitômetros e por imunofenotipagem as populações celulares presentes nesses ensaios, sendo ambos suplementados com IL3, EPO, GM-CSF e G-CSF. Os resultados mostraram que a hemopoese é afetada pela desnutrição protéica, pois encontramos hipoplasia medular, destacando-se depleção dos setores eritróides, grânulo-monocíticos e megacariocítico e bloqueio maturativo. A anemia e leucopenia demonstradas são decorrentes da hipoplasia medular e, esta parece não ser dependente da apoptose. Os resultados da análise imunofenotípica evidenciaram que as células da medula óssea de animais desnutridos, apresentam redução na expressão de CD 45, CD34, CD38, CD117, TER 119 e CD71. As populações linfoides também foram afetados pela desnutrição, destacando-se a depleção de células linfóides primitivas e maturas. Além disso, foi verificado que animais desnutridos apresentam menor produção de células sob ação e estímulo de fatores de crescimento externo, nos ensaios de CL e CSS. A análise morfológica revelou redução no número de células viáveis e de progenitores granulo-monocíticos e eritróide, sugerindo alterações intrínsecas nestas células. Os resultados obtidos tanto com PCNA e AgNOR em amostras da medula óssea foram similares: os animais desnutridos apresentaram menor número de células em atividade proliferativa. O presente trabalho sugere proliferação celular medular reduzida na desnutrição protéica, ocasionando uma hipoplasia, principalmente do setor mielóide, decorrente da diminuição da existência de células primitivas e de progenitores bem como de sua capacidade proliferativa, da disfunção da ação regulatória de fatores de crescimento, de alterações nos receptores transmembrana e os mecanismos transducionais, modificações histológicas da MO e modificações dos componentes do microambiente e da relação arquitetural desse microambiente.The protein-energy malnutrition (PEM) is the most disseminated kind of malnutrition in underdeveloped areas and the most common kind of malnutrition in newborns who are underweight according to their gestation age, hospitalised and receiving parenteral feeding patients, elderly people, individuals with nutrition problems such as anorexia nervosa and bulimia, patients who have neoplasia or chronic diseases, patients undergoing chemotherapy. In the haematopoietic system, the cellular proliferation and differentiation occur in a constant and balanced way, sensitive to specific cellular lineage demands. The stem cells auto-renewing, differentiation and cellular death control the population rate of each haematopoietic lineage. Structure and cellular alterations in haematopoietic organs have been mentioned in PEM. The reduction of the cell number of bone marrow and the incapacity to increase its production in answer to inflammatory and/or infectious stimulus may be important mechanisms responsible for the rising in the number of infections in individuals with malnutrition. The aim of this essay is to study the effect of the experimental protein deficiency in different haematopoietic lineages, as well as on the proliferation capacity ex vivo by immunocitochemical techniques (detection of silver stained organizer regions -AgNOR) and immunohistochemical (detection of proliferating cell nuclear antigen- PCNA), and in vitro cultivated in liquid culture (CL) and clonogenic assays (EC). Besides that, it evaluates the immunophenotyping profile and morphological studies in DPE. Cells with no adhesion were cultivated in liquid culture (CL), evaluating during 1, 3 and 5 days while the clonogenic assays (EC), evaluating during 7, 14 and 21 days the cellular proliferation, in analysis of cell number and by immunophenotyping the present cellular populations, being both the assays supplemented with IL3, EPO, GM-CSF, G-CS. The results showed that the haemopoiesis is affected by the protein malnutrition: marrow hypoplasia increasing was found depletion of the erythroid and granulo-monocytic components, and in more severe degrees of malnutrition, also the depletion of the megacaryocytic component and a blockage of maturation. The demonstrated anaemia and leucopoenia are due to the marrow hypoplasia at least, after the malnutrition process installation the hypoplasia is not a result of the apoptosis increase in medulla cells. The results made evident that the marrow cells of animals with malnutrition, showed reduction in the number and expression of CD45, CD34, CD117, TER 119 and CD71. Linphoid populations were also affected by malnutrition, standing out the depletion of primitive and mature linphoid cells. Moreover, it was found out that animals with malnutrition show cell production under action and stimulus of external growth factors in assays of the CL and CSS. The morphological analysis revealed reduction in the cells number and erythroid and granulo-monocytic progenitors, suggesting intrinsic changes in these cells. The obtained results, with PCNA and AgNOR in bone marrow were similar: the animals with malnutrition showed a low number of cells in proliferation activity. This present essay allowed the analysis revealed reduction in the cells number in DPE with marrow hypoplasia of the different hemopoietics populations, and the possible mechanisms may be: reduction in the existence of primitive cells and progenitors as well as their proliferation capacity; regulatory action of growth factors, of the transmembrane receptors and the signaling mechanisms and of the components of the microenvironment and of the architectural structure of this microenvironment

Efeito da desnutrição protéica experimental na hemopoese medular

A desnutrição protéico-energética (DPE) é a forma de desnutrição mais encontrada em áreas subdesenvolvidas, atingindo principalmente recém-nascidos de baixo peso para sua idade gestacional, pacientes hospitalizados sob alimentação parenteral, idosos, crianças pré-escolares, indivíduos com distúrbios alimentares como na anorexia nervosa e bulimia e pacientes portadores de neoplasias, doenças crônicas e sob quimioterapia. No sistema hematopoético, a proliferação e diferenciação celular ocorrem de forma constante e equilibrada, sensível às demandas de linhagens celulares específicas. O comportamento medular da população de cada linhagem hematopoética é controlado pelo equilíbrio entre auto-renovação das células tronco, a diferenciação e a morte celular. Alterações estruturais e celulares em órgãos hematopoéticos têm sido relatadas na DPE, com redução da celularidade de medula óssea e da sua capacidade de resposta a estímulos inflamatórios e/ou infecciosos em indivíduos desnutridos. Neste trabalho estudamos o efeito da deficiência protéica experimental em diferentes linhagens hematopoéticas, através da realização do hemograma e do mielograma; avaliamos a capacidade proliferativa ex vivo por técnicas imunocitoquímica (detecção de regiões organizadoras de nucléolo marcadas pela prata - AgNOR) e de imunohistoquímica (detecção do antígeno de proliferação nuclear - PCNA) e, em ensaios de cultura líquida e clonogênicos em metilcelulose. Paralelamente, avaliamos o perfil imunofenotípico e estudos morfológicos de células da medula óssea em DPE. Células não-derentes foram cultivadas em meio líquido (CL), avaliando-se durante 1,3 e 5 dias, e células totais foram cultivadas em metilcelulose, avaliando-se durante 7, 14 e 21 dias, em ambos os ensaios, a proliferação celular em hemocitômetros e por imunofenotipagem as populações celulares presentes nesses ensaios, sendo ambos suplementados com IL3, EPO, GM-CSF e G-CSF. Os resultados mostraram que a hemopoese é afetada pela desnutrição protéica, pois encontramos hipoplasia medular, destacando-se depleção dos setores eritróides, grânulo-monocíticos e megacariocítico e bloqueio maturativo. A anemia e leucopenia demonstradas são decorrentes da hipoplasia medular e, esta parece não ser dependente da apoptose. Os resultados da análise imunofenotípica evidenciaram que as células da medula óssea de animais desnutridos, apresentam redução na expressão de CD 45, CD34, CD38, CD117, TER 119 e CD71. As populações linfoides também foram afetados pela desnutrição, destacando-se a depleção de células linfóides primitivas e maturas. Além disso, foi verificado que animais desnutridos apresentam menor produção de células sob ação e estímulo de fatores de crescimento externo, nos ensaios de CL e CSS. A análise morfológica revelou redução no número de células viáveis e de progenitores granulo-monocíticos e eritróide, sugerindo alterações intrínsecas nestas células. Os resultados obtidos tanto com PCNA e AgNOR em amostras da medula óssea foram similares: os animais desnutridos apresentaram menor número de células em atividade proliferativa. O presente trabalho sugere proliferação celular medular reduzida na desnutrição protéica, ocasionando uma hipoplasia, principalmente do setor mielóide, decorrente da diminuição da existência de células primitivas e de progenitores bem como de sua capacidade proliferativa, da disfunção da ação regulatória de fatores de crescimento, de alterações nos receptores transmembrana e os mecanismos transducionais, modificações histológicas da MO e modificações dos componentes do microambiente e da relação arquitetural desse microambiente.The protein-energy malnutrition (PEM) is the most disseminated kind of malnutrition in underdeveloped areas and the most common kind of malnutrition in newborns who are underweight according to their gestation age, hospitalised and receiving parenteral feeding patients, elderly people, individuals with nutrition problems such as anorexia nervosa and bulimia, patients who have neoplasia or chronic diseases, patients undergoing chemotherapy. In the haematopoietic system, the cellular proliferation and differentiation occur in a constant and balanced way, sensitive to specific cellular lineage demands. The stem cells auto-renewing, differentiation and cellular death control the population rate of each haematopoietic lineage. Structure and cellular alterations in haematopoietic organs have been mentioned in PEM. The reduction of the cell number of bone marrow and the incapacity to increase its production in answer to inflammatory and/or infectious stimulus may be important mechanisms responsible for the rising in the number of infections in individuals with malnutrition. The aim of this essay is to study the effect of the experimental protein deficiency in different haematopoietic lineages, as well as on the proliferation capacity ex vivo by immunocitochemical techniques (detection of silver stained organizer regions -AgNOR) and immunohistochemical (detection of proliferating cell nuclear antigen- PCNA), and in vitro cultivated in liquid culture (CL) and clonogenic assays (EC). Besides that, it evaluates the immunophenotyping profile and morphological studies in DPE. Cells with no adhesion were cultivated in liquid culture (CL), evaluating during 1, 3 and 5 days while the clonogenic assays (EC), evaluating during 7, 14 and 21 days the cellular proliferation, in analysis of cell number and by immunophenotyping the present cellular populations, being both the assays supplemented with IL3, EPO, GM-CSF, G-CS. The results showed that the haemopoiesis is affected by the protein malnutrition: marrow hypoplasia increasing was found depletion of the erythroid and granulo-monocytic components, and in more severe degrees of malnutrition, also the depletion of the megacaryocytic component and a blockage of maturation. The demonstrated anaemia and leucopoenia are due to the marrow hypoplasia at least, after the malnutrition process installation the hypoplasia is not a result of the apoptosis increase in medulla cells. The results made evident that the marrow cells of animals with malnutrition, showed reduction in the number and expression of CD45, CD34, CD117, TER 119 and CD71. Linphoid populations were also affected by malnutrition, standing out the depletion of primitive and mature linphoid cells. Moreover, it was found out that animals with malnutrition show cell production under action and stimulus of external growth factors in assays of the CL and CSS. The morphological analysis revealed reduction in the cells number and erythroid and granulo-monocytic progenitors, suggesting intrinsic changes in these cells. The obtained results, with PCNA and AgNOR in bone marrow were similar: the animals with malnutrition showed a low number of cells in proliferation activity. This present essay allowed the analysis revealed reduction in the cells number in DPE with marrow hypoplasia of the different hemopoietics populations, and the possible mechanisms may be: reduction in the existence of primitive cells and progenitors as well as their proliferation capacity; regulatory action of growth factors, of the transmembrane receptors and the signaling mechanisms and of the components of the microenvironment and of the architectural structure of this microenvironment

Study of lymphocyte subpopulations in bone marrow in a model of protein-energy malnutrition

Objective: Protein-energy malnutrition (PEM) is an important public health problem affecting millions of people worldwide. Hematopoietic tissue requires a high nutrient supply, and a reduction in leukocytes, especially lymphocytes, suggests that some nutritional deficiencies might be altering bone marrow function and decreasing its ability to produce lymphocytes. In this study, we evaluated the effect that PEM has on lymphocyte subtypes and the cell cycle of CD5(+) cells. Methods: Swiss mice were subjected to PEM using a low-protein diet containing 4% protein. When the experimental group had lost about 20% of their original body weight, we collected blood and bone marrow cells and evaluated the hemogram, the myelogram, bone marrow lymphoid markers using flow cytometry, and the cell cycle in CD5(+) bone marrow. Results: Malnourished animals presented anemia, reticulocytopenia, and leukopenia with lymphopenia. The bone marrow was hypocellular, and flow cytometric analyses of bone marrow cells showed cells that were CD45(+) (91.2%), CD2(+) (84.9%), CD5(+) (37.3%), CD3(+) (23.5%), CD19(+) (43.3%), CD22(+) (34.7%), CD19(+)/CD2(+) (51.2%), CD19(+)/CD3(+)(24.0%), CD19(+)/CD5(+) (13.2%), CD22(+)/CD2(+) (40.1%), CD22(+)/CD3(+) (30.3%), and CD22(+)/CD5(+) (1.1%) in malnourished animals and CD45(+) (97.5%), CD2(+) (42.9%), CD5(+) (91.5%), CD3(+) (92.0%), CD19(+) (52.0%), CD22(+) (75.6%), CD19(+)/CD2(+) (62.0%), CD19(+)/CD3(+) (55.4%), CD19(+)/CO5(+) (6.7%), CD22(+)/CD2(+) (70.3%), CD22(+)/CD3(+) (55.9%), and CD22(+)/ CD5(+) (8.4%) in control animals. Malnourished animals also presented more CD5(+) cells in the G0 phase of cell cycle development. Conclusion: Malnourished animals presented bone marrow hypoplasia, maturation interruption, prominent lymphopenia with depletion in the lymphoid lineage, and changes in cellular development. We suggest that these changes are some of the primary causes of lymphopenia in cases of PEM and partly explain the increase in susceptibility to infections found in malnourished individuals. Published by Elsevier Inc.Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq), Brazi