1 research outputs found
Compensation of the effects of heterozygous protein inactivating mutations by changes in the expression of functional alleles in selected yeast strains.
Kompensacja w odpowiedzi na zmiany liczby kopii gen贸w u Saccharomyces cerevisiae jest przedmiotem bada艅 od wielu lat. Dotychczas dobrze zbadano reakcje dro偶d偶y na aneuploidie chromosomalne i delecje gen贸w, ale brakuje bada艅 na temat wp艂ywu mutacji punktowych unieczynniaj膮cych gen na zmiany poziomu mRNA. Uwa偶a si臋, 偶e niezale偶nie od rodzaju zmiany, wi臋kszo艣膰 badanych gen贸w nie jest kompensowana, a haploinsuficjencja jest niezwykle rzadkim zjawiskiem u dro偶d偶y. Celem niniejszej pracy by艂o sprawdzenie, czy knockdown jednej kopii genu spowoduje, 偶e dojdzie do podwy偶szonej ekspresji tego genu (kompensacji), oraz dodatkowo opracowanie i przetestowanie metodologii badania kompensacji ekspresji gen贸w przy u偶yciu metody real-time PCR. Badania przeprowadzono na sze艣ciu genach eksperymentalnych: RPL15B, OPT2, MET7, NAT4, SIC1 i SLG1. W wybranych do eksperymentu szczepach dro偶d偶y (Peter i in., 2018) geny te mia艂y (lub powinny mie膰) heterozygotyczn膮 mutacj臋 punktow膮 zmieniaj膮c膮 ramk臋 odczytu, lub wstawiaj膮c膮 przedwczesny kodon stop. Efektem takiej mutacji by艂o powstanie niefunkcjonalnego mRNA i bia艂ka. Do szczep贸w eksperymentalnych dobrano tak偶e szczepy kontrolne z niezmutowan膮 wersj膮 danego genu.Hodowla badanych szczep贸w dro偶d偶y mia艂a miejsce w sta艂ych warunkach, po czym przeprowadzono izolacj臋 RNA i okre艣lono poziom transkrypt贸w za pomoc膮 reakcji odwrotnej transkrypcji i real-time PCR. Dodatkowo przeprowadzono sekwencjonowanie DNA badanych gen贸w w celu potwierdzenia obecno艣ci opisanych w literaturze mutacji. Jego wynik pokaza艂, 偶e dwa z sze艣ciu wybranych gen贸w nie posiada艂y wskazanej mutacji, wi臋c geny te zosta艂y wykluczone z dalszych bada艅. Ostateczne wyniki wskaza艂y, 偶e tylko jeden z badanych gen贸w mia艂 wyra藕nie zwi臋kszon膮 ekspresj臋 i wykazywa艂 kompensacj臋, dla dw贸ch gen贸w prawdopodobnie nie zasz艂a kompensacja, ale nie mo偶na jej wykluczy膰, poniewa偶 mog艂o zaj艣膰 zjawisko NMD (ang. nonsense mediated decay). Natomiast poziom ekspresji ostatniego z gen贸w by艂 na tyle niski, 偶e mo偶na z ca艂膮 pewno艣ci膮 wykluczy膰 zaj艣cie kompensacji.Compensation in response to changes in gene copy number in Saccharomyces cerevisiae has been examined for many years. So far, yeast responses to chromosomal aneuploidy and gene deletions have been well studied, but there is a lack of research on changes in mRNA levels caused by gene inactivating point mutations. It is believed that regardless of the type of change, most of the genes are not compensated, and haploinsufficiency is an extremely rare phenomenon in yeast. The aim of this study was to check whether the knockdown of one gene copy would result in increased expression of this gene (compensation), and additionally to develop and test the methodology for examining gene expression compensation using the real-time PCR method. The research was carried out on six experimental genes: RPL15B, OPT2, MET7, NAT4, SIC1 and SLG1. In the yeast strains selected for the experiment (Peter et al., 2018), these genes had (or should have) a heterozygous point mutation changing the reading frame or inserting a premature stop codon. As a result of this mutation, there has been formed a non-functional mRNA and protein. For each experimental strain, there was selected a control strain without any mutations in the given gene. The cell culture has been kept under constant conditions, then the RNA isolation was performed and the level of transcripts was determined by reverse transcription and real-time PCR. Additionally, DNA sequencing of the tested genes was performed to confirm the presence of mutations described in the literature. The results showed that two of the six selected genes did not have the desired mutation, so these genes were excluded from further study. The final results indicated that only one of the tested genes had an increased expression and showed compensation, for two genes presumably no compensation happened, but it cannot be excluded since nonsense mediated decay (NMD) could have occurred. The expression level of the last of the genes was low enough to exclude the possibility of compensation