CRISPR-transient expression in soybean for simplified gRNA screening in planta

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método para criar e validar sistemas CRISPR-Cas e diferentes gRNAs em embriões de soja (Glycine max). Dois genes modelo foram usados para mutação simples com um gRNA ou deleção parcial do gene com dois guias. Os gRNAs foram inseridos nos vetores de transformação CRISPR por uma enzima de restrição do tipo IIS ou por subclonagem e inserção do promotor + gRNA2 no vetor de transformação final, com uso do método clássico de clonagem por enzimas de restrição. Os vetores foram construídos com sucesso para um e dois gRNAs. A transformação transiente de soja por Agrobacterium foi realizada para testar a qualidade dos gRNAs e do próprio sistema (cassete de expressão). Detectaram-se mutação simples e deleção gênica nos embriões transformados após o enriquecimento do DNA por digestão seguida de reação em cadeia da polimerase e sequenciamento, o que indica que o sistema CRISPR-Cas e os guias estavam funcionando. Este protocolo pode ser usado para acelerar as estratégias de edição de genoma baseadas em CRISPR, para transformação genética em soja.The objective of this work was to develop a method to create and validate CRISPR-Cas systems and different gRNAs in soybean (Glycine max) embryos. Two model genes were used for simple mutation with one gRNA or partial gene deletion with two guides. The gRNAs were inserted into the CRISPR transformation vectors by a type IIS restriction enzyme or by subcloning and inserting the promoter + gRNA2 in the final transformation vector using the classic restriction enzyme cloning method. The vectors were successfully constructed for one and two gRNAs. Agrobacterium-mediated transient transformation in soybean was carried out to test the quality of gRNAs and of the system itself (expression cassette). Simple mutation and gene deletion were detected in the embryos transformed after DNA enrichment by enzyme digestion followed by polymerase chain reaction and sequencing, which indicates that the CRISPR-Cas system and guides were working. This protocol can be used to accelerate CRISPR-based genome editing strategies for genetic transformation in soybean

Caracterização molecular de populações do nematóide-de-cisto-da-soja com diferentes índices de parasitismo na cultivar Hartwig

Recently, a new race of soybean cyst nematode (SCN) (Heterodera glycines) was discovered, which breaks the resistance of cultivar Hartwig, resistant to all known races of SCN. This population was obtained from soybean plants collected in the Sorriso county, state of Mato Grosso, Brazil, and is characterized as race 4. To verify if this isolate was different from others classified as races 4 and 9, their genetic diversity was analyzed by using the RAPD technique. Nine populations of SCN were analyzed, and only four populations were able to parasitize soybean plants cultivar Hartwig. Based on this study, it was verified that the populations that break Hartwig resistance were different from the other populations. Based on cluster analysis, the populations were separated into three groups. Race 4 populations were placed in the first group, while the race 9 population was placed in the second group and those capable of breaking cultivar Hartwig's resistance were placed in group three. This work confirms that the SCN population found in Sorriso is different from other isolates classified as race 4, and was called race 4+.Recentemente, foi descoberta uma raça do nematóide-de-cisto-da-soja (NCS; Heterodera glycines) que apresentou a capacidade de quebrar a resistência da cultivar Hartwig, até então considerada resistente a todas as raças conhecidas do nematóide. Essa população foi coletada no Município de Sorriso, Estado do Mato Grosso, e foi caracterizada como raça 4. Para verificar a diversidade genética entre esta e outras populações pertencentes às raças 4 e 9, foi feita uma caracterização molecular pela técnica de marcadores moleculares RAPD. Foram utilizadas nove populações do NCS, das quais quatro apresentavam a capacidade de parasitar 'Hartwig'. Foi verificado que as populações capazes de parasitar 'Hartwig' foram bastante diferentes das demais. Por meio de análise de agrupamento, com base nas distâncias genéticas encontradas, foram obtidos três grupos: o primeiro, constituído por indivíduos classificados como raça 4, mas que não parasitam 'Hartwig'; o segundo, constituído por quatro populações capazes de parasitar 'Hartwig', e o terceiro, por apenas uma população, classificado como raça 9, e que também não parasita 'Hartwig'. Este estudo confirmou que a população de NCS, encontrada em Sorriso, é geneticamente distinta das demais populações da raça 4 encontradas e constitui uma nova raça, denominada 4+

Tolerância à seca em cultivares-elite de soja com a introgressão do transgene AtAREB1

The objective of this work was to verify if the introgression of the AtAREB1 gene in the 'LS93-0375' and 'BMX Desafio RR' elite soybean germplasms increases the tolerance of these plants to water deficit. The F4 progenies of these two elite cultivars and of the AtAREB1 transgenic line (BR16-AtAREB1) and its background ('BR16') were subjected to water deficit assays. The water deficit bioassays were performed in a greenhouse using the following six soybean lines: the genetically modified BR16-AtAREB1 and its background 'BR16'; 'LS93' and its F4 progeny, LS93-AtAREB1; and 'BMX Desafio RR' and its F4 progeny, Desafio-AtAREB1. A randomized complete block experimental design was carried out in a 6x2 factorial arrangement, with  the six soybean genotypes and two water conditions – control (C) and water deficit (WD) treatments – with nine replicates. Soybean genotypes containing the AtAREB1 gene showed better physiological performances under drought stress and altered expressions of drought-responsive genes. The intogression of AtAREB1 in soybean increases the plant drought tolerance, regardless of the genetic background in which the gene was introduced.O objetivo deste trabalho foi verificar se a introgressão do gene AtAREB1 em dois germoplasmas-elite de soja, 'LS93-0375' e 'BMX Desafio RR', aumenta a tolerância dessas plantas ao deficit hídrico. As progênies F4 das duas cultivares-elite e da linhagem transgênica AtAREB1 (BR16-AtAREB1) e de seu background ('BR16') foram submetidas a deficit hídrico. Os bioensaios de deficit hídrico foram realizados em casa de vegetação, tendo-se utilizado as seis seguintes linhagens de soja: a geneticamente modificada BR16-AtAREB1 e seu background 'BR16'; 'LS93' e sua progênie F4, LS93-AtAREB1; e 'BMX Desafio RR' e sua progênie F4, Desafio-AtAREB1. Utilizou-se delineamento experimental de blocos completos com tratamentos casualizados, em arranjo fatorial 6x2, com os seis genótipos de soja e duas condições hídricas – controle (C) e tratamentos de deficit hídrico (WD) –, com nove repetições. Os genótipos de soja que contêm o gene AtAREB1 exibiram melhor desempenho fisiológico sob estresse hídrico e expressão alterada de genes responsivos à seca. A introgressão de AtAREB1 na soja aumenta a tolerância à seca, independentemente do background genético em que o gene foi introduzido

Size of AT(n) Insertions in Promoter Region Modulates Gmhsp17.6-L mRNA Transcript Levels

During earlier experiments, an SSR molecular marker (176 Soy HSP) showing high correlation (70%) with resistance/susceptibility to javanese root-knot nematode Meloidogyne javanica was identified in soybean. After being sequenced, results indicated that the SSR 176 Soy HSP marker was inserted in the promoter region of Gmhsp17.6-L gene. It was also detected in this region that resistant genotypes presented insertions between AT(31) and AT(33) in size and susceptible genotypes, AT(9). Gmhsp17.6-L gene coding region presented a perfect match in amino acid sequence in all soybean genotypes. A ribonuclease protection assay showed that Gmhsp17.6-L gene mRNA transcripts were present in all genotypes. A real-time relative quantification (qPCR) indicated in the resistant individuals higher mRNA transcripts levels, which presented in the sequencing more AT(n) insertions. These results suggest that the number of AT(n) insertions inside this promoter region could modulate up or down gene levels. Those findings can lead to the possibility of manipulating, between some limits, the mRNA transcripts levels using different sizes of AT(n) insertions

Implications of ethylene biosynthesis and signaling in soybean drought stress tolerance

Abstract\ud \ud Background\ud Ethylene is a phytohormone known for inducing a triple response in seedlings, leaf abscission and other responses to various stresses. Several studies in model plants have evaluated the importance of this hormone in crosstalk signaling with different metabolic pathways, in addition to responses to biotic stresses. However, the mechanism of action in plants of agricultural interest, such as soybean, and its participation in abiotic stresses remain unclear.\ud \ud \ud Results\ud The studies presented in this work allowed for the identification of 176 soybean genes described elsewhere for ethylene biosynthesis (108 genes) and signal transduction (68 genes). A model to predict these routes in soybean was proposed, and it had great representability compared to those described for Arabidopsis thaliana and Oryza sativa. Furthermore, analysis of putative gene promoters from soybean gene orthologs permitted the identification of 29 families of cis-acting elements. These elements are essential for ethylene-mediated regulation and its possible crosstalk with other signaling pathways mediated by other plant hormones.\ud From genes that are differentially expressed in the transcriptome database, we analyzed the relative expression of some selected genes in resistant and tolerant soybean plants subjected to water deficit. The differential expression of a set of five soybean ethylene-related genes (MAT, ACS, ACO, ETR and CTR) was validated with RT-qPCR experiments, which confirmed variations in the expression of these soybean target genes, as identified in the transcriptome database. In particular, two families of ethylene biosynthesis genes (ACS and ACO) were upregulated under these experimental conditions, whereas CTR (involved in ethylene signal transduction) was downregulated. In the same samples, high levels of ethylene production were detected and were directly correlated with the free fraction levels of ethylene’s precursor. Thus, the combination of these data indicated the involvement of ethylene biosynthesis and signaling in soybean responses to water stress.\ud \ud \ud Conclusions\ud The in silico analysis, combined with the quantification of ethylene production (and its precursor) and RT-qPCR experiments, allowed for a better understanding of the importance of ethylene at a molecular level in this crop as well as its role in the response to abiotic stresses. In summary, all of the data presented here suggested that soybean responses to water stress could be regulated by a crosstalk network among different signaling pathways, which might involve various phytohormones, such as auxins, ABA and jasmonic acid. The integration of in silico and physiological data could also contribute to the application of biotechnological strategies to the development of improved cultivars with regard to different stresses, such as the isolation of stress-specific plant promoters.This research was financially supported by grants from the Brazil Higher\ud Education Personnel Training Coordination (CAPES), the Brazil National\ud Council for Scientific and Technological Development (CNPq), the Brazilian\ud Foundation for Research Support (FAP-DF) and Embrapa Genetic Resources\ud and Biotechnology (Brazil)

Caracterização molecular de populações do nematóide-de-cisto-da-soja com diferentes índices de parasitismo na cultivar Hartwig

Recentemente, foi descoberta uma raça do nematóide-de-cisto-da-soja (NCS; Heterodera glycines) que apresentou a capacidade de quebrar a resistência da cultivar Hartwig, até então considerada resistente a todas as raças conhecidas do nematóide. Essa população foi coletada no Município de Sorriso, Estado do Mato Grosso, e foi caracterizada como raça 4. Para verificar a diversidade genética entre esta e outras populações pertencentes às raças 4 e 9, foi feita uma caracterização molecular pela técnica de marcadores moleculares RAPD. Foram utilizadas nove populações do NCS, das quais quatro apresentavam a capacidade de parasitar 'Hartwig'. Foi verificado que as populações capazes de parasitar 'Hartwig' foram bastante diferentes das demais. Por meio de análise de agrupamento, com base nas distâncias genéticas encontradas, foram obtidos três grupos: o primeiro, constituído por indivíduos classificados como raça 4, mas que não parasitam 'Hartwig'; o segundo, constituído por quatro populações capazes de parasitar 'Hartwig', e o terceiro, por apenas uma população, classificado como raça 9, e que também não parasita 'Hartwig'. Este estudo confirmou que a população de NCS, encontrada em Sorriso, é geneticamente distinta das demais populações da raça 4 encontradas e constitui uma nova raça, denominada 4+

Quantitative differential expression of alpha and beta ryanodine receptor genes in PSE (Pale, Soft, Exudative) meat from two chicken lines: broiler and layer

Total RNA isolated from Pectoralis major muscle from PSE (L*24h>53.0, pH"53) meats of two phenotypically distinct chicken lines, broiler and layer, was used to investigate the α-ryr and β-ryr gene expression by real-time RT-PCR approach. Mean relative quantification (RQ) values were lower (p0.05) in α-ryr gene expression regardless of line studied. The β-ryr RQ results suggested that in PSE samples an alteration might occur in the regular ratio (1:1) of α-RyR/β-RyR normally found in avian muscles. These results provided the first evidence of PSE meat occurrence as a result of the differential expression of ryanodine receptor genes which might lead to an increased in Ca2+ availability at the cell milieu.As proteínas α-RyR e β-RyR apresentam papéis distintos no mecanismo de excitação-contração com diferenças em seus mecanismos de ativação e respostas a ligantes. O RNA total de filé de peito (Pectoralis major m) com PSE (L*24h>53,0; pH 5,8) e não-PSE (4453) de duas linhagens distintas, de corte e de postura, foram utilizadas para estudar a expressão gênica dos genes α-ryr β-ryr por PCR-em-tempo-real. Os valores médios de expressão gênicas relativas (RQ) foram inferiores (p0,05) na expressão do , independentemente da linhagem estudada. Os resultados de RQ para β-ryr indicaram nas amostras PSE, uma alteração na proporção (1:1) de α-RyR/β-RyR comumente encontrada em músculos de aves. Estes resultados originam a primeira evidência da ocorrência de carnes PSE como resultado de uma disponibilidade acentuada de Ca2+ no citosol pela expressão diferenciada de proteínas receptoras de rianodina