2 research outputs found
Ultra-high resolution structure determination of transition metal substituted human carbonic anhydrase 2 - inhibitor complexes
Paramagnetic Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is developing to aid the characterization of
paramagnetic molecules, whose paramagnetic centers changes the spectroscopic proprieties of said
molecules. These paramagnetic centers can be exploited to overcome some troublesome aspects of
NMR, such as sensitivity, by increasing the number of experiments. To aid this development, we used
human Carbonic Anhydrase II (hCAII), which is a model protein that contains zinc(II) in its active center,
which is diamagnetic. hCAII is an enzyme capable of interconverting carbon dioxide to bicarbonate,
making it one of the most important proteins in life. Several comprehensive studies have structurally
and functionally characterized hCAII making it an excellent model protein. Furthermore, the metal ion in
the active center can be substituted by other transition metals ions (see chapter 1), such as cobalt(II)
(see chapter 3), nickel(II) (see chapter 4) and copper(II) (see chapter 5), which are paramagnetic that
will help answering different problems described in this thesis.
The ion cobalt(II), explored in chapter 3, can induce considerable changes on the NMR
observables and is useful to understand the interactions of ligands with proteins. For this we used
cobalt(II)-hCAII and used NMR, Electron Paramagnetic Resonance (EPR) and X-ray crystallography to
characterize the interaction of thiocyanate under high concentrations with the hCAII. The addition of 500
mM of sodium thiocyanate changes the dynamics of the protein without changing the protein structure.
Solid-state NMR (SSNMR) is another field of NMR where the methodological and practical
aspects are currently under development to reach better sensitivity and resolution. We proposed the
usage of nickel(II)-hCAII as a paramagnetic molecule to increase the amount of tools in SSNMR, which
is explored in chapter 4. The nickel(II) ion is capable of breaking the dipolar bath by changing the
frequency of the nuclei close to the paramagnetic center, thus increasing the resolution and sensitivity
of the SSNMR experiments. Furthermore, in parallel we discovered that hCAII is capable of binding two
nickel(II) ions, one in the active center, as expected and described in literature, and one in the N-terminal
site of the protein, a novel discovery.
The description of the paramagnetic effects, such as the Pseudocontact Shifts (PCS), in the NMR
observables have been subjected to debate, where different treatments of theoretical equations were
clashing. The experimental proof to determine which equation holds true is fully described in chapter 5.
For this, we developed copper(II)-hCAII to acquire NMR and EPR data under the same conditions, and
determine which equations describe better the PCS. The data interpretation from different techniques
(both NMR and EPR) led us to conclude that the original treatment from Kurland and McGarvey equation
is the correct one.A Ressonância Magnética Nuclear Paramagnética (RMN) tornou-se uma importante ferramenta
para complementar as técnicas clássicas de RMN em estudos estruturais de metaloproteínas. Os seus
centros paramagnéticos intrínsecos ou extrínsecos perturbam suas propriedades espectroscópicas de
RMN, incluindo desvios químicos, acoplamentos dipolares residuais (RDCs) e tempos de relaxação
nuclear. Os desvios de pseudocontato (PCS), as mudanças de RDC e as contribuições paramagnéticas
nas taxas de relaxamento nuclear, induzidas por esses centros, podem ser exploradas para melhorar
a qualidade das estruturas de proteínas derivadas de RMN, aumentando o número e o tipo de restrições
estruturais que podem ser usadas.
Contribuindo para este desenvolvimento, foi utilizada a Anidrase Carbónica II (hCAII) humana,
como uma proteína modelo que contém um ião zinco(II) diamagnético no centro ativo. hCAII catalisa a
interconversão de dióxido de carbono em bicarbonato, tornando-se uma das proteínas mais
importantes da vida. Vários estudos caracterizaram estruturalmente e funcionalmente a hCAII,
tornando-a uma excelente proteína modelo. Além disso, o ião metálico no centro ativo pode ser
substituído por outros iões de metais de transição paramagnéticos, conforme apresentado no capítulo
1, como cobalto(II) (ver capítulo 3), níquel(II) (ver capítulo 4) e cobre(II) (ver capítulo 5), cujas
contribuições paramagnéticas para os parâmetros de RMN (apresentadas no capítulo 2) podem ajudar
a responder aos diferentes problemas descritos nesta tese.
No capítulo 3, cobalto(II)-hCAII foi usada para caracterizar as interações de hCAII com altas
concentrações de tiocianato. Ao combinar as alterações induzidas por paramagnéticos nas observáveis
de RMN, dados de Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR) e cristalografia de raios-X, concluiu-
se que a adição de 500 mM de tiocianato de sódio altera a dinâmica da proteína sem alterar a estrutura
da proteína.
A RMN de estado sólido (SSNMR) é outro campo da RMN onde os aspetos metodológicos e
práticos estão atualmente em desenvolvimento para alcançar melhor sensibilidade e resolução. No
capítulo 4, níquel(II)-hCAII é explorada como uma molécula paramagnética para aumentar a quantidade
de ferramentas disponíveis em SSNMR. O ião níquel(II) é capaz de quebrar o banho dipolar alterando
a frequência dos núcleos próximos ao centro paramagnético, aumentando assim a resolução e a
sensibilidade dos experimentos SSNMR. Além disso, em paralelo, descobriu-se que hCAII é capaz de
se ligar a dois iões níquel(II), um no centro ativo, conforme esperado e descrito na literatura, e um novo
na sequência N-terminal da proteína.
A descrição teórica dos efeitos paramagnéticos, como os PCS, nas observáveis de RMN tem
sido objeto de debate, onde diferentes tratamentos foram conflitantes, fornecendo diferentes equações
teóricas. A prova experimental para determinar qual equação é correta está descrita de forma completa
no capítulo 5. Para isso, a cobre(II)-hCAII foi preparada e usada para adquirir dados de RMN e EPR
nas mesmas condições, e determinou-se qual equação descreve melhor os PCS experimentais. A
interpretação dos dados de diferentes técnicas (tanto RMN quanto EPR) levou-nos a concluir que o tratamento clássico da equação de Kurland e McGarvey é o correto e não aquele derivado da mecânica
quântica
Biophysical characterization of a novel membrane mimicking system
NADH: ubiquinone oxidoredutase is one of the most intricate enzymes. It is part of the respiratory chains and is present in several organisms. This enzyme couples the transfer of two electron, from NADH to ubiquinone, and translocate ions across the membrane establishing a transmembrane difference of electrochemical potential. In this work, we present the initial experimental steps to express and purify a subunit from this intricate enzyme, which is directly related with the translocation of ions (i.e. NuoL). The objective was to characterize the subunit reconstituted in membrane-mimicking nanoparticles called nanodiscs using solution Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy