Ultra-high resolution structure determination of transition metal substituted human carbonic anhydrase 2 - inhibitor complexes

Paramagnetic Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is developing to aid the characterization of paramagnetic molecules, whose paramagnetic centers changes the spectroscopic proprieties of said molecules. These paramagnetic centers can be exploited to overcome some troublesome aspects of NMR, such as sensitivity, by increasing the number of experiments. To aid this development, we used human Carbonic Anhydrase II (hCAII), which is a model protein that contains zinc(II) in its active center, which is diamagnetic. hCAII is an enzyme capable of interconverting carbon dioxide to bicarbonate, making it one of the most important proteins in life. Several comprehensive studies have structurally and functionally characterized hCAII making it an excellent model protein. Furthermore, the metal ion in the active center can be substituted by other transition metals ions (see chapter 1), such as cobalt(II) (see chapter 3), nickel(II) (see chapter 4) and copper(II) (see chapter 5), which are paramagnetic that will help answering different problems described in this thesis. The ion cobalt(II), explored in chapter 3, can induce considerable changes on the NMR observables and is useful to understand the interactions of ligands with proteins. For this we used cobalt(II)-hCAII and used NMR, Electron Paramagnetic Resonance (EPR) and X-ray crystallography to characterize the interaction of thiocyanate under high concentrations with the hCAII. The addition of 500 mM of sodium thiocyanate changes the dynamics of the protein without changing the protein structure. Solid-state NMR (SSNMR) is another field of NMR where the methodological and practical aspects are currently under development to reach better sensitivity and resolution. We proposed the usage of nickel(II)-hCAII as a paramagnetic molecule to increase the amount of tools in SSNMR, which is explored in chapter 4. The nickel(II) ion is capable of breaking the dipolar bath by changing the frequency of the nuclei close to the paramagnetic center, thus increasing the resolution and sensitivity of the SSNMR experiments. Furthermore, in parallel we discovered that hCAII is capable of binding two nickel(II) ions, one in the active center, as expected and described in literature, and one in the N-terminal site of the protein, a novel discovery. The description of the paramagnetic effects, such as the Pseudocontact Shifts (PCS), in the NMR observables have been subjected to debate, where different treatments of theoretical equations were clashing. The experimental proof to determine which equation holds true is fully described in chapter 5. For this, we developed copper(II)-hCAII to acquire NMR and EPR data under the same conditions, and determine which equations describe better the PCS. The data interpretation from different techniques (both NMR and EPR) led us to conclude that the original treatment from Kurland and McGarvey equation is the correct one.A Ressonância Magnética Nuclear Paramagnética (RMN) tornou-se uma importante ferramenta para complementar as técnicas clássicas de RMN em estudos estruturais de metaloproteínas. Os seus centros paramagnéticos intrínsecos ou extrínsecos perturbam suas propriedades espectroscópicas de RMN, incluindo desvios químicos, acoplamentos dipolares residuais (RDCs) e tempos de relaxação nuclear. Os desvios de pseudocontato (PCS), as mudanças de RDC e as contribuições paramagnéticas nas taxas de relaxamento nuclear, induzidas por esses centros, podem ser exploradas para melhorar a qualidade das estruturas de proteínas derivadas de RMN, aumentando o número e o tipo de restrições estruturais que podem ser usadas. Contribuindo para este desenvolvimento, foi utilizada a Anidrase Carbónica II (hCAII) humana, como uma proteína modelo que contém um ião zinco(II) diamagnético no centro ativo. hCAII catalisa a interconversão de dióxido de carbono em bicarbonato, tornando-se uma das proteínas mais importantes da vida. Vários estudos caracterizaram estruturalmente e funcionalmente a hCAII, tornando-a uma excelente proteína modelo. Além disso, o ião metálico no centro ativo pode ser substituído por outros iões de metais de transição paramagnéticos, conforme apresentado no capítulo 1, como cobalto(II) (ver capítulo 3), níquel(II) (ver capítulo 4) e cobre(II) (ver capítulo 5), cujas contribuições paramagnéticas para os parâmetros de RMN (apresentadas no capítulo 2) podem ajudar a responder aos diferentes problemas descritos nesta tese. No capítulo 3, cobalto(II)-hCAII foi usada para caracterizar as interações de hCAII com altas concentrações de tiocianato. Ao combinar as alterações induzidas por paramagnéticos nas observáveis de RMN, dados de Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR) e cristalografia de raios-X, concluiu- se que a adição de 500 mM de tiocianato de sódio altera a dinâmica da proteína sem alterar a estrutura da proteína. A RMN de estado sólido (SSNMR) é outro campo da RMN onde os aspetos metodológicos e práticos estão atualmente em desenvolvimento para alcançar melhor sensibilidade e resolução. No capítulo 4, níquel(II)-hCAII é explorada como uma molécula paramagnética para aumentar a quantidade de ferramentas disponíveis em SSNMR. O ião níquel(II) é capaz de quebrar o banho dipolar alterando a frequência dos núcleos próximos ao centro paramagnético, aumentando assim a resolução e a sensibilidade dos experimentos SSNMR. Além disso, em paralelo, descobriu-se que hCAII é capaz de se ligar a dois iões níquel(II), um no centro ativo, conforme esperado e descrito na literatura, e um novo na sequência N-terminal da proteína. A descrição teórica dos efeitos paramagnéticos, como os PCS, nas observáveis de RMN tem sido objeto de debate, onde diferentes tratamentos foram conflitantes, fornecendo diferentes equações teóricas. A prova experimental para determinar qual equação é correta está descrita de forma completa no capítulo 5. Para isso, a cobre(II)-hCAII foi preparada e usada para adquirir dados de RMN e EPR nas mesmas condições, e determinou-se qual equação descreve melhor os PCS experimentais. A interpretação dos dados de diferentes técnicas (tanto RMN quanto EPR) levou-nos a concluir que o tratamento clássico da equação de Kurland e McGarvey é o correto e não aquele derivado da mecânica quântica

Biophysical characterization of a novel membrane mimicking system

NADH: ubiquinone oxidoredutase is one of the most intricate enzymes. It is part of the respiratory chains and is present in several organisms. This enzyme couples the transfer of two electron, from NADH to ubiquinone, and translocate ions across the membrane establishing a transmembrane difference of electrochemical potential. In this work, we present the initial experimental steps to express and purify a subunit from this intricate enzyme, which is directly related with the translocation of ions (i.e. NuoL). The objective was to characterize the subunit reconstituted in membrane-mimicking nanoparticles called nanodiscs using solution Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy