生理活性物質定量化のための複合型多機能バイオセンサーの開発とその生体計測への応用

本研究は複数の超微少液性情報変化を同時に解析できる多機能バイオセンサを開発するため、その基礎研究として、(1)微小透析プローブによる生理活性物質の分離と高感度測定法の確立、(2)基質選択性酵素センサの開発、(3)水晶振動子マイクロバランスを利用した免疫センサの開発の各研究テーマについて検討し、以下の結果を得た。 I.微小透析プローブ (1)In vitroでのノリアドレナリン相対回収率は約20%であり、その検出限界は500fg/40μlであった。 (2)ノリアドレナリンの回収に関する基礎実験をラット内側前頭前野および脾臓で行い、十分満足のいく結果が得られた。 II.酵素センサ (1)本研究で作製したグルコースオキシダーゼ固定化センサは、基質選択性、感度及び濃度依存性に関して十分満足のいくものであった。 (2)低溶存酸素溶液中では、グルコースセンサの感度の低下が認められるが、フェロセンを電子メディエータとして介在させることによりセンサの感度が維持できた。 III.免疫センサ (1)水晶振動子をマイクロバランスとして用いることができる。またその感度は1Hz/ngときわめて高い。 (2)水晶振動子電極表面にチラミンを電解重合し、アミノ基を導入後、グルタルアルデヒドを用い抗体(抗ヒトIgG)のアミノ基との間にシッフ塩基形成反応を行わせた。これにより抗体を電極表面に効率よく固定化できる。 (3)各種濃度のヒトIgG溶液(10,30,50μg/ml)投与によってきわめてゆっくりとした時間変化で振動数が変化し、IgG50μg/ml投与の場合、約20分後に最大振動数変化200Hzに達した。一方、ウシ血清アルブミン(10μg/ml)を投与しても、IgG投与時に観察されたような顕著な振動数変化が認められないことから、この反応は非特異的タンパク結合などによるものではない。The purpose of this research project was to accomplish the biosensors which can detect the endogenous substances influencing neuronal activity in the brain. For this purpose, the characteristics of the following sensors were studied ; (1) microdialysis sensor for separation and analysis of bioactive substances, (2) enzyme biosensor for detection of glucose immobilized with glucose oxidase and (3) a quartz crystal microbalance sensor for immunosorbent assay.1. Microdialysis biosensorNoradrenaline release in the medial prefrontal cortex and spleen of rats was studied. The detection limit of the microdialysis sensor system for noradrenaline was 500 fg/40 mul at a 3 : 1 signal to noise ratio. A series of experiments using pharmacological and physiological manipulations indicated that the noradrenaline recovered in the dialysate was mainly derived from nerve terminals.2. Enzyme biosensorGlucose oxidase was immobilized onto platinum electrode to attain stabilized activity. The concentration response characteristics and the stability of the sensor were studied for glucose concentrations of 0.1-10.0mM.Steady state response of the sensor was proportional to the glucose concentration up to 5 mM.The slope of the linear correlation of sensor response was inversely proportional to the dissolved oxygen concentration. The decrease in sensor response caused by the reduction of dissolved oxygen concentration was overcome by using ferrocene carboxialdehyde as an electron mediator.3. Quartz crystal microbalance sensorDetermination of human immunoglobulin G (IgG) was performed by using a piezoelectric crystal biosensor system, which was consist of an AT-cut quarts piezoelectriccrystal, oscillator and frequency counter. Anti-human IgG was immobilized onto the surface of the gold electrode with tyramine and glutaraldehyde. The resonant frequency shift resulting from the affinity reaction of anti-IgG and IgG correlated with a concentration of IgG in the range of 10mug/ml-50mug/ml. The crystal sensor showed no response to bovine serum albumin.研究課題/領域番号:05558115, 研究期間(年度):1993–1995出典：「生理活性物質定量化のための複合型多機能バイオセンサーの開発とその生体計測への応用」研究成果報告書　課題番号05558115(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

組織認識能を有する二酸化チタン・ナノ粒子の新規がん治療への応用

金沢大学環日本海域環境研究センターわれわれは二酸化チタンに超音波を照射することにより活性酸素種(ラジカル分子)が発生する現象を見出した。この現象をがん治療への新たな手法として応用することが本研究の目的である。本申請研究では(1)チノ二酸化チタン包括ターゲティングリポソームの開発、(2)創製した二酸化チタンと超音波照射法を培養細胞に適用することで、どのようながん治療の効果が得られるのか検討、そして(3)がん組織(がん細胞)におけるラジカル攻撃の分子レベルの挙動解析の3点について検討を行った。(1)項においては、センダイウィルスや特定のタンパク質をリポソーム表面に固定化した二酸化チタン包括リポソームの構築を完了した。更に、このリポソームを用いて、(2)項にて培養細胞との融合実験および、超音波照射による細胞死滅効果について検討を行い。二酸化チタンの効率的取り込みと、取り込んだ細胞における超音波照射による効果的な細胞死滅現象が確認できた。そして(3)項では、細胞の死滅機構にラジカルが関与していることが実証できた。この事より、二酸化チタン・超音波照射法によりラジカルが発生し、そのラジカルが細胞死を誘導していることが示唆できた。研究課題/領域番号:17016028, 研究期間(年度):2005出典：「組織認識能を有する二酸化チタン・ナノ粒子の新規がん治療への応用」研究成果報告書　課題番号17016028（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17016028/)を加工して作

環境変動の受容と脳・免疫系応答における脾臓交感神経の機能的意義

金沢大学工学部本研究目的は,各種ストレス状態によってひき起こされる,恒常性維持のための生体防御の中枢統御機構を明らかにすることにある.このため,(1)神経活性物質の動態を無麻酔無拘束で解析できる脾臓マイクロダイアリシス法を確立し,(2)これにより環境・情動ストレスおよびストレス関連物質による脾臓交感神経活動抑制機構を脾臓ノルアドレナリン(NA)の動態レベルで解析する.拘束ストレス開始後,脾臓NAは潜時20分以内に,基礎遊離量の約8倍にまで増大しその後20分間持続した.しかし,その後拘束ストレスの持続にもかかわらず,NAの遊離が減弱していくいわゆる順応反応が観察されたが,拘束解放後も数時間にわたって拘束前置の約2倍と有意に高かった.この拘束ストレスによるNAの遊離は,あらかじめ脾臓交感神経を切除することにより著名に抑制されることから,脾臓交感神経から遊離されたNAを反映していると考えられる.また拘束ストレスにより脾臓ナチュラルキラー細胞の活性が有意に抑制されたが,この抑制も脾臓交感神経の切除により有意に減弱することが判明した.一方,corticotropin-releasingfctor(CRF)の側脳室内投与(2μg)により,脾臓NA濃度は2峰性に増大し,それぞれ投予後20分および140分で最高値(投与前値の300%)を示した.さらに,IL-1βの腹腔内投与によっても脾臓NAは有意に増大し,投予後40分で最高値(投与前値の200%)となった後緩やかに回復したが,投予後80分においてもその増加は有意であった.このIL-1βの腹腔内投与による脾臓NAの増加は,CRF受容体の拮抗薬であるα-helical CRFを側脳室内に前投与することにより有意に減弱した.以上の結果は,サイトカインによる環境ストレス・脳-免疫系機能連関を示唆する.研究課題/領域番号:08670079, 研究期間(年度):1996出典：研究課題「環境変動の受容と脳・免疫系応答における脾臓交感神経の機能的意義」課題番号08670079（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-08670079/）を加工して作

機能性バイオ融合ナノ粒子と超音波化学をカップリングした新規がん治療

金沢大学環日本海域環境研究センター我々は光触媒(二酸化チタン)に超音波を照射すると極めて強い酸化力を有するOHラジカルが高濃度で生成する現象を報告した(二酸化チタン・超音波触媒法)。この現象を新規がん治療に応用することが本研究の目的である。このためB型肝炎ウィルス外皮タンパク質(preS1/S2タンパク質)を固定化した二酸化チタン・ナノ粒子を用いて,in vitroでの培養がん細胞への取込みおよびin vivoでの二酸化チタン・超音波触媒法による抗腫瘍効果を検討した。抗preS1抗体を用いた免疫染色法によってpreSl/S2固定化二酸化チタンの肝細胞認識能を調べた。preS1/S2固定化二酸化チタンを添加した場合,ヒト肝臓がん由来細胞であるHepG2において強い赤色蛍光を示した。一方,ヒト大腸がん由来細胞であるWiDrではpreS1/S2固定化二酸化チタンを添加しても赤色蛍光は示さなかった。以上の結果より,preS1/S2タンパク質は肝細胞に特異的な領域を有するタンパク質であり,かつpreS1/S2固定化二酸化チタンは肝細胞に特異的に取り込まれることが判明した。ヒト肝臓がん由来細胞株HepG2を移植した担がんマウスを用いて二酸化チタン・超音波触媒法による抗腫瘍効果について検討した。二酸化チタン粒子添加投与および超音波照射の有無に関わらず時間経過とともに腫瘍は成長する結果となり,今回の二酸化チタン投与条件および超音波照射条件では二酸化チタン・超音波触媒法による抗腫瘍効果は確認できなかった。今後,in vitroの実験においては,細胞死のメカニズムをより詳細に解析すること,in vivoの実験においては,二酸化チタン粒子の投与条件および超音波照射条件の更なる検討が必要である。また,今回作製したpreS1/S2固定化二酸化チタン粒子の肝細胞特異性を確認するため,粒子の体内挙動に関しても解析を行う必要がある。研究課題/領域番号:18015019, 研究期間(年度):2006 – 2007出典：「機能性バイオ融合ナノ粒子と超音波化学をカップリングした新規がん治療」研究成果報告書　課題番号18015019（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18015019/)を加工して作

ラジカル発生機能を有するバイオ融合ナノ粒子による新規がん治療法の確立

金沢大学自然計測応用研究センターわれわれは二酸化チタンに超音波を照射することにより活性酸素(ラジカル分子)が発生する現象を見出した。この現象をがん治療への新たな手法として応用することが本研究の目的である。本研究で提案する超音波照射法にてラジカルを発生させれば、皮膚組織や臓器の表面だけでなく深部のがん組織においても治療が可能となり、非侵襲的で根治性の高いがん治療法を開発できる。そこで本申請研究では(1)二酸化チタン表面に生体認識分子を配向化し、血流中を移動できるナノ構造化の検討(2)創製した二酸化チタンと超音波照射法を担がん動物に適用することで、どのようながん治療の効果が得られるかの2点について検討を行った。(1)項においては、中心に磁性粒子を有する機能性二酸化チタン微粒子の構築が確認でき、構築微粒子の光触媒活性をメチレンブルー分解にて評価した結果、光触媒活性を有することも確認できた。更に、チタン・ナノ粒子内包リポソームも構築でき、がん細胞との融合実験に用いることが出来るレベルであることが明らかとなった。(2)項では、腫瘍細胞の生存率は超音波照射時間に依存して減少する事が明らかとなった。超音波照射のみでも腫瘍細胞死滅の効果はみられるものの、二酸化チタンを添加することでより効果的に腫瘍細胞を死滅できることが明らかとなった。研究課題/領域番号:15025227, 研究期間(年度):2003出典：「ラジカル発生機能を有するバイオ融合ナノ粒子による新規がん治療法の確立」研究成果報告書　課題番号15025227（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-15025227/)を加工して作

機能性生体分子を配向した光触媒ナノ粒子の創製とその医療応用

金沢大学環日本海域環境研究センター我々は光触媒(二酸化チタン)に超音波を照射すると極めて酸化力の強いOHラジカルが高濃度に生成する現象を報告した。この「二酸化チタン、超音波触媒法」にてラジカルを発生させれば,皮膚組織などの表層部位だけでなく臓器深部の腫瘍組織においても有効な治療が可能となり,非侵襲的な新規がん治療法を開発できる。この非侵襲的かつ臓器機能温存型の「新規がん治療法」を開発するための基盤技術として,「腫瘍細胞を特異的に認識する機能性光触媒ナノ粒子」を作製することが本研究の目的である。二酸化チタンはその等電点が中性付近にあり,表面処理を行わずに体内に投与した場合,ナノ粒子が容易に凝集する可能性がある。特に血中投与では様々なタンパク質との相互作用など,不確定な要素も数多く存在する。このため本研究では粒子表面をポリアクリル酸で修飾し,静電的相互作用でナノ粒子を水溶液中で安定に分散させた。これを用いて二酸化チタン濃度変化によるがん細胞膜損傷効果を検討した。超音波を照射しない場合,二酸化チタン添加による乳酸脱水素酵素活性のわずかな増大が認められた。これと比較して,二酸化チタシを添加後に超音波照射を行うと,二酸化チタン濃度に比例して細胞からの乳酸脱水素酵素漏出が有意に増大した。この結果は,二酸化チタン、超音波触媒法による細胞膜損傷が二酸化チタンから生成するOHラジカルに起因する可能性を示唆する。さらに培養液中に二酸化チタン粒子を添加後,生細胞数の経時変化に対する超音波照射の影響を調べた。二酸化チタン粒子添加のみでは細胞は正常に増殖するのに対し,二酸化チタン粒子添加後に超音波を照射すると生細胞数が約50%にまで減少し,その後の増殖も完全に抑制された。またナノ粒子表面のカルボキシル基を用いて各種抗体やGFPなどのタンパク質の修飾も行えることを確認し,がん細胞を認識する二酸化チタンナノ粒子作製の基礎を確立できた。研究課題/領域番号:18650143, 研究期間(年度):2006 – 2007出典：「機能性生体分子を配向した光触媒ナノ粒子の創製とその医療応用」研究成果報告書　課題番号18650143（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18650143/)を加工して作

バイオアフィニティを利用する多機能バイオセンシングシステムの開発

1.微小透析バイオセンサの開発 (1)酸化電流値のグルコース濃度依存性 グルコース濃度依存性を調べた結果、酸化電流値はグルコース濃度に比例して増加した。検出限界濃度は0.01mMであり、また5mM以上では直線性が認められなくなった。酵素固定化型の電極と比較して電流値の再現性は優れていた。 (2)溶存酸素依存性と電子メディエータの導入 グルコースオキシダーゼはその反応過程で酸素を必要とする。したがって低溶存酸素の状態では、センサの感度が低下する可能性がある。予め窒素ガスをバブリングすることで溶存酸素濃度を低下させた場合、感度の低下と応答時間に対する時定数の増加が見られた。フェロセンを電子メディエータとして白金電極とグルコースオキシダーゼの間に介在させることで、低溶存酸素領域でもセンサの感度を維持することができた。 (3)pHの影響 酵素には至適pHがあり、センサの識別素子として用いる場合にはpHの影響を調べる必要がある。そこでグルコースオキシダーゼ溶液をpH=5.6、試料溶液のグルコース濃度を1.0mMに設定し、溶液中のリン酸緩衝液のpH5.6〜8.0まで変化させ、試料溶液中のpHの影響を調べた。その結果、pH5.6から7.5の範囲において試料溶液中のpHの影響を受けないことが明らかとなった。これは、酵素が透析膜によって外液のpH変化から保護されているためと考えられる。 2.水晶振動子を用いた免疫センサの開発 AT-cutの水晶板上に金を蒸着し、ピエゾ圧電効果を利用した超微小量質量測定センサを作製し、電極表面にヤギ抗ヒトIgGを固定化し、IgGの測定について検討した。抗体は金電極表面上にチラミンを電解重合後、チラミン-グルタルアルデヒドー抗体のアミノ基間にシッフ塩を形成させることにより安定に固定化することができた。このセンサの電極質量変化と基本振動数との間には比例関係が成立し、その感度は1ng/Hzであった。各種濃度のヒトIgG溶液に対する免疫センサ応答の経時的変化を調べた結果、IgG投与によって振動数が極めてゆっくりとした時間経過で変化し、IgG50μg/ml投与では約20分後に最大振動数変化が200Hzに達した。The purpose of this research project was to accomplish the biosensing system which can detect the endogenous chemical substances influencing neuronal activities in the brain. For this purpose, the characteristics of the following sensors were studied ; (1) enzyme microdialysis biosensor and (2) a quarts crystal microbalance biosensor for immunosorbent assay.1. Enzyme microdialysis biosensorThe concentric biosensor was consisted of glass body with a semi-permeable membrane at the tip, working electrode and an inlet and outlet capillary for the perfusion of enzyme solution. The working electrode and the inlet capillary were inserted into a semi-permeable hollow fiber (o.d.=220 μm). The advantage of the biosensor was that the micro-environment around the working electrode could be easily changed by perfusing the enzyme solution. Glucose oxidase was used in this study and steady state response of the sensor was proportional to the glucose concentration up to 5mM.The detection limit of the glucose concentration was 0.01 mM.The decrease in the sensitivity caused by the reduction of dissolved oxygen concentration was overcome by using ferrocene carboxyaldehyde as an electron mediator.2. Quarts crystal microbalance biosensorThe piezoelectric crystals were studied under various operational conditions and were also applied to the determination of human IgG concentration. AT-cut crystals, with a basic resonant frequency of 9 MHz, were modified by immobilizing goat anti-human IgG onto the surface of crystal electrode with tyramine and glutaraldehyde. The immobilization technique improved the long term stability of the biosensor, and the change in frequency caused by the adsorption of material onto the surface of electrode was confirmed to be 1 Hz/ng. The shift in frequency resulting from the reaction of human IgG and goat anti-human IgG correlated with a concentration range of 10μg/ml-50 μg/ml. The suitability of this technique for neurophysiological studies was confirmed for investigation of the chemical fluctuations in vivo.研究課題/領域番号:10557006, 研究期間(年度):1998–2000出典：「バイオアフィニティを利用する多機能バイオセンシングシステムの開発」研究成果報告書　課題番号10557006(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

バイオアフィニティを利用する生理活性物質の新規微量定量法の確立

金沢大学工学部種々の化学物質を測定対象とするバイオセンサの開発が注目されているが、これらの多くは酸化酵素によって発生する過酸化水素の酸化電流値を電気化学的に検出する方式であり、測定物質が限定され、神経ペプチドなどの測定に適用した例はない。本研究は水晶振動子を高感度マイクロバランスとして利用し、抗原・抗体反応によって生ずる電極表面上での特異的質量変化を水晶振動子の基本周波数変化から求めるという新規の発想である。このため、(1)水晶振動子を高感度マイクロバランスとして利用するための理論解析と特性評価及び高感度化、(2)抗体などの生体物質をいかに効率よく、また活性を維持して固定化するかについて追及し、以下の成果を得た。(1) AT-cutの水晶結晶板上に金を蒸着し、ピエゾ圧電効果を利用した水晶振動子センサを作製した。この水晶振動子の電極の質量変化と基本振動数との間には比例関係が成立し、水晶振動子のマイクロバランス(微量天秤)としてナノグラムオーダーでの微量成分の検出・定量が可能であった。所定濃度のNaCl水溶液をサンプル液として電極表面に既知量の蒸発残留物を形成させ、その残留物質量と基本振動数の変化量を調べた。その結果、電極上の残留物質量(10〜100ng)と振動数変化との間に有意な直線関係が認められ、その傾きは1.0Hz/ngであった。(2) チラミンの電解重合により、電極表面にアミノ基を導入後、グルタルアルデヒドの架橋反応により抗体のアミノ基との間にシッフ塩基を形成せた。これにより電極表面に抗体を安定に固定化できた。(3) 水晶振動子マイクロバランス免疫センサを用いて抗原-抗体反応の検出が可能であり、抗原濃度と免疫センサの応答には有意な相関が認められた。研究課題/領域番号:09877017, 研究期間(年度):1997 – 1998出典：研究課題「バイオアフィニティを利用する生理活性物質の新規微量定量法の確立 」課題番号09877017（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09877017/）を加工して作

環境・情動ストレス関連物質の動態と視床下部生体警告情報処理機構の解析

1.拘束ストレスによる摂食行動の抑制 (1)拘束ストレスによって摂食量の有意な低下が起こる。これはセロトニン受容体拮抗薬のmethysergideおよびセロトニン1Aレセプターの特異的アゴニストである8OH-DPATの前投与で有意に拮抗された。 (2)抗不安作用を有するdiazepam(DZP)の投与は短潜時で摂食行動を誘起するが、これはDZPのpartial inverse agonistであり、不安惹起作用を有するFG7142の投与で有意に拮抗できた。 2.視床下部セロトニンおよび内側前頭前野ノルアドレナリン(NA)の動態 (1)拘束ストレス後視床下部外側野でセロトニンの遊離が有意に増加し、これはDZPあるいは8OH-DPATの前投与により完全に阻害できた。内側前頭前野でのNAの遊離も拘束ストレスによって有意に増大するが、これはbenzodiazepine系、CRF系によって修飾されている可能性がある。 (2)拘束ストレスによる内側前頭前野のNA遊離はCRFの特異的拮抗薬であるα-herical CRFを大脳側脳室内へ前投与すると有意に拮抗できる。またCRFの側脳室内投与により短潜時で内側前頭前野のNA遊離が促進される。 3.脾臓交感神経終末からのNA遊離 拘束ストレスは脾臓交感神経からのNA遊離を有意に促進することをマイクロダイアリシス法で明らかにした。これは脾臓を支配する交感神経の切除によって有意に抑えられた。さらに拘束ストレスを負荷したときに免疫反応(NK活性)が低下し、これも除神経により有意に拮抗されることなどから、脾臓交感神経終末から放出されたノルアドレナリンがNK活性を抑制すると考えられる。This study was designed to study the dynamic changes in serotonin (5HT) and noradrenaline (NA) levels during the stressful stimuli, and have reached the following conclusions in rats. (1) Immobilization-stress caused anorexia in conjunction with an immediate increase in thehypothalamic 5HT release. Injection of 5HT receptor antagonist significantly reduced the immobilization-induced anorexia, suggesting that the hypothalamic serotonergic ystem is activated during stress and 5HT is an inhibitory transmitter in feeding behavior. (2) Immobilization elevated NA levels in the medial prefrontal cortex (PFC). Pre-injection of a benzodiazepine receptor agonist, diazepam, significantly attenuated the immobilization-induced NA release, while the injection of an anxiogenic compound, FG7142, facilitated it in non-stressed condition. Thus the stressfull stimuli activate the NA system in the medial PFC which may be modulated by an activation of the benzodiazepine receptors in the brain. (3) Immobilization-stress rapidly increased NA levels of spleen in conjunction with the suppression of natural killer (NK) cytotoxicity. Both theincreased levelsof NA ad he suppresion of NK cytotoxicity were significantly attenuated after surgical denervation of the splenic sympathetic nerve, indicating that immobilization-induced suppression of splenic N/K cytotoxicity was mediated predominantly through enhanced activity of the splenic sympathetic nerve..These results suggest that both 5HT and NA may act asneurotransmitters and/or neuromodlators which regulate biowarning processes in the living body.研究課題/領域番号:04670095, 研究期間(年度):1992–1993出典：「環境・情動ストレス関連物質の動態と視床下部生体警告情報処理機構の解析」研究成果報告書　課題番号04670095(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作