VALYL-TRNA SYNTHETASE INTERACTS WITH Β-SUBUNIT OF THE EUKARYOTIC TRANSLATION ELONGATION FACTOR COMPLEX eEF1B

The aim of this study was to investigate the interaction of the N-terminal domain of the valyl-tRNA synthetase with α, β, and γ subunits of the eEF1B translation elongation factor complex. Methods: for this purpose, all 4 proteins were synthesized in bacterial cells and purified to homogeneity by a combination of chromatographic methods. The interaction of the eEF1B complex subunits with the N-terminal domain of the valyl-tRNA synthetase was verified by gel filtration and in vitro pull-down assays. Protein fractions collected at these stages were analyzed by SDS-PAGE. Results: according to the gel filtration results, eEF1Bα and eEF1Bγ subunits do not form a stable complex with the valine-tRNA synthetase domain. The potential for complexation of the eEF1Bβ subunit was evaluated by pull-down assay, which showed that this protein does interact with the valyl-tRNA synthetase. Conclusions: we concluded that the eEF1Bα and eEF1Bγ subunits do not interact with the valyl-tRNA synthetase compared to the eEF1Bβ protein. The N-terminal domain of the valyl-tRNA synthetase is necessary and sufficient for this interaction

Leucine-zipper motif is responsible for self-association of translation elongation factor 1Bβ

Translation elongation factor 1Bβ (eEF1Bβ) is a metazoan-specific protein catalyzing the guanine nucleotide exchange on translation elongation factor 1A (eEF1A). eEF1Bβ was reported to form oligomers. Aim. To define the structural region of human eEF1Bβ that mediates its self-association. In addition, the various truncated forms of this protein were tested in the guanine nucleotide exchange assay with two isoforms of mammalian eEF1A. Methods. The truncated forms of eEF1Bβ were generated by PCR, cloned, expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. Their apparent molecular masses were determined by analytical gel filtration and their guanine nucleotide exchange activities were assessed by filter binding assay. Results. Complete deletion of the N-terminal domain of eEF1Bβ does not affect its oligomerization propensity while deletion of the leucine-zipper motif drastically decreases the apparent molecular mass of the truncated form compared to the full-length protein. Also, the leucine-zipper motif of eEF1Bβ fused to glutathione S-transferase causes oligomerization of the chimeric protein. It was demonstrated that all N-terminally truncated forms of eEF1Bβ displayed similar catalytic activity to that of the full-length protein. Weak inhibitory effect on the catalytic activity was observed only for the truncated form with partially deleted central acidic region. Conclusions. The leucine-zipper motif facilitates oligomerization of recombinant eEF1Bβ. Stepwise deletion of the eEF1Bβ N-terminal domain does not significantly affect the guanine nucleotide exchange activity of the truncated proteins.Фактор елонгації трансляції 1Bβ(eEF1Bβ) – це білок, наявний лише у багатоклітинних організмів. Він каталізує обмін гуанінових нуклеотидів на факторі елонгації трансляції 1A (eEF1A). Відомо, що eEF1Bβ утворює олігомери. Мета. Визначити структурний домен eEF1Bβ людини, який опосередковує його олігомеризацію. Для встановлення ймовірного впливу N-кінцевої ділянки eEF1Bβ на каталітичну активність цього білка, було перевірено здатність різних вкорочених форм eEF1Bβ каталізувати обмін гуанінових нуклеотидів на обох ізоформах eEF1A ссавців. Методи. Фрагменти кДНК, які кодують вкорочені форми, eEF1Bβ отримували шляхом ПЛР ампліфікації, потім клонували у відповідні вектори, які експресували в клітинах Escherichia coli. Рекомбінантні білки очищали і їхні молекулярні маси визначали аналітичною гель-фільтрацією. Активність вкорочених форм eEF1Bβ перевіряли в реакції обміну гуанінових нуклеотидів. Результати. Видалення N-кінцевого домену eEF1Bβ не вплинуло на його олігомерізацію, в той час як видалення мотиву типу «лейцинова застібка» значно зменшувало молекулярну масу вкороченої форми білка в порівнянні з повнорозмірною. Також, амінокислотний мотив eEF1Bβ типу «лейцинова застібка» злитий з глутатіон S-трансферазою спричиняв олігомерізацію цього химерного білка. Показано, що всі вкорочені з N-кінця форми eEF1Bβ проявляли каталітичну активність, подібну до повнорозмірного білка. Інгібіторний ефект на каталітичну активність спостерігався лише для вкороченої форми білка, в якої була відсутня частина центрального негативно зарядженого регіону. Висновки. Амінокислотний мотив типу «лейцинова застібка» сприяє олігомерізації рекомбінантного eEF1Bβ. Поступове вкорочення N-кінцевого домену не має значного впливу на каталітичну активність eEF1Bβ.Фактор элонгации трансляции 1Bβ (eEF1Bβ) – белок, присутствующий только в многоклеточных организмах. Он катализирует обмен гуаниновых нуклеотидов на факторе элонгации трансляции 1A (eEF1A). Известно, что eEF1Bβ образует олигомеры. Цель. Определить структурный домен eEF1Bβ человека, который вызывает его олигомеризацию. Для исследования возможного влияния N-концевого участка eEF1Bβ на каталитическую активность этого белка, мы проверили способность различных укороченных форм eEF1Bβ катализировать обмен гуаниновых нуклеотидов на обеих изоформах eEF1A млекопитающих. Методы. Фрагменты кДНК, кодирующие укороченные формы eEF1Bβ, получали при помощи ПЦР амплификации, потом клонировали в соответствующие вектора, которые экспрессировали в клетках Escherichia coli. Рекомбинантные белки очищали и их молекулярные массы определяли аналитической гель-фильтрацией. Активность укороченных форм eEF1Bβ проверяли в реакции обмена гуаниновых нуклеотидов. Результаты. Полное удаление N-концевого домена не влияло на олигомеризацию eEF1Bβ, однако удаление мотива типа «лейцинова застёжка» значительно уменьшало молекулярную массу укороченной формы белка по сравнению с полноразмерной. Также, присоединение аминокислотного мотива eEF1Bβ типа «лейциновая застёжка» к глутатион S-трансферазе вызвало олигомеризацию этого химерного белка. Показано, что все укороченные с N-конца формы eEF1Bβ проявляли такую же каталитическую активность, как и полноразмерный белок. Слабый ингибирующий эффект на каталитическую активность наблюдался лишь для укороченной формы белка с отсутствующей частью центрального негативно заряженного региона. Выводы. Аминокислотный мотив типа «лейциновая застёжка» способствует олигомеризации рекомбинантного eEF1Bβ. Постепенное укорочение N-концевого домена не оказывает значительного влияния на каталитическую активность eEF1Bβ

PTI-1: novel way to oncogenicity

Aim. The prostate tumor-inducing oncogene (PTI-1), presumably encoding a truncated form of eukaryotic translation elongation factor 1A1 (eEF1A1), was discovered as a gene overexpressed in prostate tumor samples and absent in normal tissues. The mechanism of PTI-1 oncogenicity remains obscure. Methods. Several bioinformatics methods were applied to analyze the PTI-1 mRNA structure, translation efficiency and coding potential. Results. In silico analysis of 5'UTR of its mRNA suggest that PTI-1 mRNA most probably belongs to the class of templates with low translation efficiency. Additionally, novel open reading frame (ORF) starting with alternative initiation site situated upstream of the main ORF start codon was found. Finally, the peptide that does not resemble eEF1A1 but is partially homologous to relaxin can be synthesized. Conclusions. We suggest that the alternative upstream start codon may initiate synthesis of a peptide (uPTI-1) homologous to relaxin, the hormone shown to promote the prostate cancer progression. uPTI-1 protein may interact with the respective relaxin-specific receptors, suggesting that the tumorigenic outcome of PTI-1 is possibly realized via the relaxin-dependent pathway. Keywords: prostate cancer, PTI-1, eEF1A1, non-coding RNA, relaxin, ORF, uAUG.Мета. Онкоген, який індукує рак простати (PTI-1), може кодувати вкорочену форму фактора елонгації eEF1A1. PTI-1 відкрито як ген, що надекспресується у зразках раку простати і не екпресується у нормальній тканині. Механізм онкогенної дії PTI-1 на сьогодні залишається нез’ясованим. Методи. Біоінформатичні методи застосовано для аналізу структури, ефективності трансляції і кодуючого потенціалу мРНК PTI-1. Результати. Аналізом in silico 5'UTR мРНК PTI-1 виявлено, що зазначений транскрипт належить до класу мРНК з низькою ефективністю трансляції. Додатково визначено нову відкриту рамку зчитування (ORF), яка починається з альтернативного старт-кодону і передує основній ORF. Пептид, що не має гомології з eEF1A1, але частково гомологічний релаксину, потенційно може синтезуватися з цієї альтернативної ORF. Висновки. Ми припустили, що з альтернативного старт-кодону починається синтез пептиду (uPTI-1), гомологічного релаксину, – гормону, що, як відомо, бере участь в індукції раку простати. Білок uPTI-1 може взаємодіяти з відповідним рецептором клітини, специфічним для релаксину, спричиняючи її трансформацію. Таким чином, онкогенна дія гена PTI-1 може реалізуватися релаксин-опосередкованим шляхом. Ключові слова: рак простати, PTI-1, eEF1A1, некодуюча РНК, релаксин, ORF, uAUG.Цель. Онкоген, индуцирующий рак простаты (PTI-1), может кодировать укороченную форму фактора элонгации eEF1A1. PTI-1 открыт как ген, сверхэкспрессирующийся в образцах рака простаты и не экспрессирующийся в нормальной ткани. Механизм онкогенного действия PTI-1 на сегодня остается неизвестным. Методы. Биоинформатические методы применены для анализа структуры, эффективности трансляции и кодирующего потенциала мРНК PTI-1. Результаты. С использованием анализа in silico 5'UTR мРНК PTI-1 виявлено, что указанный транскрипт принадлежит к классу мРНК с низкой эффективностью трансляции. Дополнительно определена новая открытая рамка считывания (ORF), начинающаяся с альтернативного старт-кодона и находящаяся перед основной ORF. Пептид, не имеющий гомологии с eEF1A1, но частично гомологичный релаксину, потенциально может синтезироваться с этой альтернативной ORF. Выводы. Мы предположили, что с альтернативного старт-кодона начинается синтез пептида (uPTI-1), гомологичного релаксину, – гормону, участвующему, как известно, в индукции рака простаты. Белок uPTI-1 может взаимодействовать с соответствующим рецептором клетки, специфическим для релаксина, приводя к ее трансформации. Таким образом, онкогенное действие гена PTI-1 может реализоваться релаксин-опосредованным путем. Ключевые слова: рак простаты, PTI-1, eEF1A1, некодирующая РНК, релаксин, ORF, uAUG

Association of mitochondrial lysyl-tRNA synthetase with HIV-1 GagPol involves catalytic domain of the synthetase and transframe and integrase domains of Pol

Aim. Analyze the interaction between Lysyl-tRNA synthetase (LysRS) and HIV-1 GagPol to know whether a particular N-terminal sequence of mitochondrial LysRS triggers a specific recognition with GagPol. Methods. Yeast two-hybrid analysis, immunoprecipitation. Results. We have shown that LysRS associates with the Pol domain of GagPol. Conclusions. A model of the assembly of the LysRS:tRNA₃Lys:GagPol packaging complex is proposed. Keywords: tRNA₃Lys, lysyl-tRNA synthetase, HIV-1, packaging.Мета. Встановити, чи може N-кінцева послідовність, яка є специфічною для мітохондріальної форми лізил-тРНК синтетази, забезпечувати взаємодію цього ферменту з білком GagPol ВІЛ-1. Методи. Двогібридна дріжджова система, імунопреципітація. Результати. Ми показали що лізил-тРНК синтетаза взаємодіє з доменом Pol білка Gag. Висновки. Запропоновано модель утворення комплексу ЛізРС:тРНК₃Ліз:GagPol. Ключові слова: тРНК₃Ліз, лізил-тРНК синтетаза, ВІЛ-1, збирання віріона.Цель. Выяснить, может ли N-концевая последовательность, являющаяся специфичной для митохондриальной формы лизилтРНК синтетазы, обеспечивать взаимодействие этого фермента с белком GagPol ВИЧ-1. Методы. Двугибридная дрожжевая система, иммунопреципитация Результаты. Мы показали, что лизил-тРНК синтетаза взаимодействует с доменом Pol белка Gag. Выводы. Предложена модель образования комплекса ЛизРС:тРНК₃Лиз:GagPol. Ключевые слова: тРНК₃Лиз, лизил-тРНК синтетаза, ВИЧ-1, сборка вириона

Specific features of protein biosynthesis in higher eukaryotes

Over 40 years of studies in the field of higher eukaryotic translation are summarized in the review. Among the pioneer results obtained we should especially accentuate the following: i) discovery of the adaptation of tRNAs and aminoacyl-tRNA synthetases (ARSs) cellular pools to the synthesis of specific proteins and modulation of the elongation rate by rare isoacceptor tRNAs; ii) the chaperone-like properties of the translation components (ribosomes and elongation factor eEF1A); characterization of high molecular weight complexes of ARSs; iii) functional compartmentalization, including channeling of tRNA in eukaryotic cells; iv) molecular mechanisms of channeling mediated by different non-canonical complexes involving eEF1A, tRNA and aminoacyl-tRNA synthetases; v) characterization of the crystal structure of eEF1A2; vi) comparison of spatial structure, molecular dynamics, tyrosine phosphorylation and abilities to interact with different protein partners of the eEF1A1 and eEF1A2 isoforms; vii) discovery of the microRNA-mediated control of the expression of the proto-oncogenic eEF1A2 isoform in cancer cells; viii) examination of the cancer-related changes in translation elongation complex eEF1H and mechanisms of oncogene PTI-1 action; ix) discovery of the third tRNA binding site on mammals ribosomes and the allosteric interaction of the 80S ribosomal A and E sites.В огляд підсумовано найвагоміші результати більш ніж сорокалітніх досліджень особливостей трансляції у вищих евкаріотів, з-поміж яких: 1) відкриття адаптації клітинних пулів тРНК і аміноацил-тРНК синтетаз (АРСаз) до синтезу специфічних білків і модуляції швидкості елонгації рідкісними ізоакцепторними тРНК; 2) визначення шапероноподібних властивостей компонентів апарату трансляції (рибосом і фактора елонгації eEF1A), характеристика високомолекулярних комплексів АРСаз; 3) встановлення функціональної компартменталізації, у тому числі каналювання тРНК в евкаріотних клітинах; 4) з’ясування молекулярних механізмів каналювання, що відбувається за посередництвом різних неканонічних комплексів, які містять eEF1A, тРНК і АРС-ази; 5) характеристика кристалічної структури eEF1A2; 6) порівняння просторової організації, молекулярної динаміки, тирозинового фосфорилювання і здатності до взаємодії з різними білками – партнерами ізоформ eEF1A1 i eEF1A2; 7) виявлення ролі мікроРНК у контролі експресії протоонкогенної ізоформи eEF1A2 в ракових клітинах; 8) вивчення спричинених раком змін комплексу факторів елонгації трансляції eEF1H і механізмів дії онкогену PTI-1; 9) відкриття третього сайта зв’язування тРНК у рибосомах ссавців та алостеричної взаємодії А- і Е-сайтів 80S рибосоми.В обзоре суммированы наиболее значимые результаты более чем сорокалетнего исследования особенностей трансляции у высших эукариот, среди них: 1) открытие адаптации клеточных пулов тРНК и аминоацил-тРНК синтетаз (АРСаз) к синтезу специфических белков и модуляции скорости элонгации редкими изоакцепторными тРНК; 2) определение шапероноподобных свойств компонентов аппарата трансляции (рибосом и фактора элонгации eEF1A) и характеристика высокомолекулярных комплексов АРСаз; 3) установление функциональной компартментализации, включающей каналирование тРНК в эукариотных клетках; 4) выяснение молекулярных механизмов каналирования, опосредованного неканоническими комплексами, содержащими eEF1A, тРНК и АРС-азы; 5) характеристика кристаллической структуры eEF1A2; 6) сравнение пространственной организации, молекулярной динамики, тирозинового фосфорилирования и способности к взаимодействию с различными белками – партнерами изоформ eEF1A1 и eEF1A2; 7) выявление роли микроРНК в контроле экспрессии протоонкогенной изоформы eEF1A2 в раковых клетках; 8) изучение связанных с раком изменений комплекса факторов элонгации трансляции eEF1H и механизмов действия онкогена РТІ-1; 9) открытие третьего сайта связывания тРНК в рибосомах млекопитающих и аллостерического взаимодействия А- и Е-сайтов на 80S рибосомах

Characterization of novel peptide-specific antibodies against the translation elongation factor eEF1A2 and their application for cancer research

Aim. We intend to characterize the new peptide-specific antibodies against the isoform 2 of translation elongation factor 1A (eEF1A2) and determine its presence in the postoperative samples of human breast, lung and stomach tumor tissues. Methods. The analysis of antibody specificity was performed by enzyme-linked immunosorbent assay, immunoblotting and immunohistochemistry. Immunoblotting and immunohistochemistry were used for the determination of the eEF1A2 in the human tumor samples, as well as in the samples of normal tissues surrounding tumors. Results. The antibodies obtained against the eEF1A2 specifically recognized this protein in the cell extracts and histological sections and did not cross-react with the elongation factor 1A isoform 1. eEF1A2 was revealed in the postoperative samples of breast, lung and stomach tumors as well as in the putative normal tissues surrounding tumors. Conclusions. The antibodies obtained against eEF1A2 are highly specific for the antigen and can be used for the immunological studies of tumors.Мета. Охарактеризувати особливості нових пептидоспецифічних антитіл проти другої ізоформи фактора елонгації трансляції 1А (eEF1A2). Визначити присутність цієї ізоформи у післяопераційних зразках пухлин молочної залози, легенів, шлунку людини і порівняти із зразками умовної норми відповідних тканин. Методи. Специфічність антитіл аналізували методами імуноферментного аналізу, імуноблотингу та імуногістохімії. Iмуноблотинг та iмуногiстохімію використано для визначення eEF1A2 в зразках пухлин людини, а також умовної норми. Результати. Встановлено, що отримані антитіла проти eEF1A2 специфічно розпізнають зазначений білок в екстрактах та на гістологічних зрізах і не виявляють перехресної взаємодії з першою ізоформою фактора елонгації. Визначено, що фактор eEF1A2 присутній в післяопераційних зразках пухлин молочної залози, легенів і шлунку, а також в умовно нормальних зразках цих тканин. Висновки. Нами одержано високоспецифічні антитіла проти eEF1A2, які можна використовувати в імунологічних дослідженнях зразків пухлин.Цель. Охарактеризовать особенности новых пептидоспецифических антител против второй изоформы фактора элонгации трансляции 1А (eEF1A2). Определить наличие этой изоформы в послеоперационных образцах опухолей молочной железы, легких, желудка человека и сравнить с условной нормой соответствующих тканей. Методы. Специфичность антител анализировали методами иммуноферментного анализа, иммуноблотинга и иммуногистохимии. Методы иммуноблоттинга и иммуногистохимии использовали для определения eEF1A2 в образцах опухолей человека, а также условной нормы. Результаты. Установлено, что полученные антитела против eEF1A2 специфически распознают этот белок в экстрактах и на гистологических срезах и не выявляют перекрестного взаимодействия с первой изоформой фактора элонгации. Мы определили, что фактор eEF1A2 присутствует в послеоперационных образцах молочной железы, легких и желудка, а также в условно нормальных образцах этих тканей. Выводы. Полученные нами антитела против eEF1A2 являются высокоспецифическими по отношению к антигену и могут быть использованы в иммунологических исследованиях опухолей

Leucine-zipper motif is responsible for self-association of translation elongation factor 1Bβ

Translation elongation factor 1Bβ (eEF1Bβ) is a metazoan-specific protein catalyzing the guanine nucleotide exchange on translation elongation factor 1A (eEF1A). eEF1Bβ was reported to form oligomers. Aim. To define the structural region of human eEF1Bβ that mediates its self-association. In addition, the various truncated forms of this protein were tested in the guanine nucleotide exchange assay with two isoforms of mammalian eEF1A. Methods. The truncated forms of eEF1Bβ were generated by PCR, cloned, expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. Their apparent molecular masses were determined by analytical gel filtration and their guanine nucleotide exchange activities were assessed by filter binding assay. Results. Complete deletion of the N-terminal domain of eEF1Bβ does not affect its oligomerization propensity while deletion of the leucine-zipper motif drastically decreases the apparent molecular mass of the truncated form compared to the full-length protein. Also, the leucine-zipper motif of eEF1Bβ fused to glutathione S-transferase causes oligomerization of the chimeric protein. It was demonstrated that all N-terminally truncated forms of eEF1Bβ displayed similar catalytic activity to that of the full-length protein. Weak inhibitory effect on the catalytic activity was observed only for the truncated form with partially deleted central acidic region. Conclusions. The leucine-zipper motif facilitates oligomerization of recombinant eEF1Bβ. Stepwise deletion of the eEF1Bβ N-terminal domain does not significantly affect the guanine nucleotide exchange activity of the truncated proteins.Фактор елонгації трансляції 1Bβ(eEF1Bβ) – це білок, наявний лише у багатоклітинних організмів. Він каталізує обмін гуанінових нуклеотидів на факторі елонгації трансляції 1A (eEF1A). Відомо, що eEF1Bβ утворює олігомери. Мета. Визначити структурний домен eEF1Bβ людини, який опосередковує його олігомеризацію. Для встановлення ймовірного впливу N-кінцевої ділянки eEF1Bβ на каталітичну активність цього білка, було перевірено здатність різних вкорочених форм eEF1Bβ каталізувати обмін гуанінових нуклеотидів на обох ізоформах eEF1A ссавців. Методи. Фрагменти кДНК, які кодують вкорочені форми, eEF1Bβ отримували шляхом ПЛР ампліфікації, потім клонували у відповідні вектори, які експресували в клітинах Escherichia coli. Рекомбінантні білки очищали і їхні молекулярні маси визначали аналітичною гель-фільтрацією. Активність вкорочених форм eEF1Bβ перевіряли в реакції обміну гуанінових нуклеотидів. Результати. Видалення N-кінцевого домену eEF1Bβ не вплинуло на його олігомерізацію, в той час як видалення мотиву типу «лейцинова застібка» значно зменшувало молекулярну масу вкороченої форми білка в порівнянні з повнорозмірною. Також, амінокислотний мотив eEF1Bβ типу «лейцинова застібка» злитий з глутатіон S-трансферазою спричиняв олігомерізацію цього химерного білка. Показано, що всі вкорочені з N-кінця форми eEF1Bβ проявляли каталітичну активність, подібну до повнорозмірного білка. Інгібіторний ефект на каталітичну активність спостерігався лише для вкороченої форми білка, в якої була відсутня частина центрального негативно зарядженого регіону. Висновки. Амінокислотний мотив типу «лейцинова застібка» сприяє олігомерізації рекомбінантного eEF1Bβ. Поступове вкорочення N-кінцевого домену не має значного впливу на каталітичну активність eEF1Bβ.Фактор элонгации трансляции 1Bβ (eEF1Bβ) – белок, присутствующий только в многоклеточных организмах. Он катализирует обмен гуаниновых нуклеотидов на факторе элонгации трансляции 1A (eEF1A). Известно, что eEF1Bβ образует олигомеры. Цель. Определить структурный домен eEF1Bβ человека, который вызывает его олигомеризацию. Для исследования возможного влияния N-концевого участка eEF1Bβ на каталитическую активность этого белка, мы проверили способность различных укороченных форм eEF1Bβ катализировать обмен гуаниновых нуклеотидов на обеих изоформах eEF1A млекопитающих. Методы. Фрагменты кДНК, кодирующие укороченные формы eEF1Bβ, получали при помощи ПЦР амплификации, потом клонировали в соответствующие вектора, которые экспрессировали в клетках Escherichia coli. Рекомбинантные белки очищали и их молекулярные массы определяли аналитической гель-фильтрацией. Активность укороченных форм eEF1Bβ проверяли в реакции обмена гуаниновых нуклеотидов. Результаты. Полное удаление N-концевого домена не влияло на олигомеризацию eEF1Bβ, однако удаление мотива типа «лейцинова застёжка» значительно уменьшало молекулярную массу укороченной формы белка по сравнению с полноразмерной. Также, присоединение аминокислотного мотива eEF1Bβ типа «лейциновая застёжка» к глутатион S-трансферазе вызвало олигомеризацию этого химерного белка. Показано, что все укороченные с N-конца формы eEF1Bβ проявляли такую же каталитическую активность, как и полноразмерный белок. Слабый ингибирующий эффект на каталитическую активность наблюдался лишь для укороченной формы белка с отсутствующей частью центрального негативно заряженного региона. Выводы. Аминокислотный мотив типа «лейциновая застёжка» способствует олигомеризации рекомбинантного eEF1Bβ. Постепенное укорочение N-концевого домена не оказывает значительного влияния на каталитическую активность eEF1Bβ

Structural dissection of human translation elongation factor 1Bγ (eEF1Bγ): expression of full-length protein and its truncated forms

Aim. To gain more insights into properties of the human translation elongation factor eEF1Bγ and its interaction with partners we intended to produce the full-length protein and its truncated forms. Methods. cDNAs encoding truncated forms of eEF1Bγ were generated by PCR amplification with respective primers and cloned into vectors providing polyhistidine, glutathione S-transferase or maltose binding protein tags. The recombinant proteins were expressed in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. An aggregation state of the proteins was analyzed by analytical gel filtration. Results. The expression, purification and storage conditions for the full-length recombinant His-eEF1Bγ were optimized. Several truncated forms of eEF1Bγ were also expressed and purified to homogeneity. Two short variants of C-terminal domain comprising amino acids 263–437 or 228–437 were obtained in monomeric state. Two short variants of N-terminal domain comprising amino acids 1–33 or 1–230, fused with glutathione S-transferase, were obtained and estimated to be dimers by gel filtration. The mutants of N-terminal domain comprising amino acids 1–93 or 1–165, fused with maltose binding protein, were obtained as soluble high molecular weight aggregates only. Conclusions. The purified recombinant His-eEF1Bγ and several truncated forms of the protein were obtained and characterized. These protein variants will be used for further studies on the protein-protein interaction.Мета. Для детального вивчення властивостей фактора елонгації трансляції eEF1Bγ людини і його взаємодії з партнерами оптимізувати експресію кДНК повнорозмірного білка та його вкорочених форм. Методи. кДНК, які кодують вкорочені форми eEF1Bγ, синтезували методом ПЛР-ампліфікації з відповідними праймерами і клонували у вектори, що містять які афінну мітку полігістидинову послідовність, глутатіон S-трансферазу або білок, який зв’язує мальтозу. Рекомбінантні білки експресували в бактеріях і очищували афінною хроматографією. Агрегатний стан отриманих білків аналізували з використанням аналітичної гель-фільтрації. Результати. Оптимізовано експресію, очищення та умови зберігання повнорозмірного рекомбінантного His-eEF1Bγ. Також експресовано і очищено до гомогенного стану кілька вкорочених форм eEF1Bγ. Дві вкорочені форми С-кінцевого домену, які містять амінокислотні залишки 263–437 і 228–437, отримано у вигляді розчинних мономерних білків. Дві вкорочені форми N-кінцевого домену, що містять амінокислотні залишки 1–33 і 1–230, злиті з глутатіон S-трансферазою, одержано у вигляді димерів згідно з результатами гель-фільтрації. Інші делеційні мутанти, які містять амінокислотні залишки 1–93 і 1–165 N-кінцевого домену та злиті з білком, що зв’язує мальтозу, можуть бути отримані лише у вигляді розчинних високомолекулярних агрегатів. Висновки. Отримано і охарактеризовано рекомбінантний білок His-eEF1Bγ та його чотири вкорочені форми. Ці форми в подальшому буде використано для вивчення білково-білкових взаємодій.Цель. Для более детального изучения свойств человеческого фактора элонгации трансляции eEF1Bγ и его взаимодействия с партнерами оптимизировать експрессию кДНК полноразмерного белка, а также его усеченных форм. Методы. кДНК, кодирующие укороченные формы eEF1Bγ, генерировали методом ПЦР-амплификации с соответствующими праймерами и клонировали в векторы, содержащие в качестве аффинной метки полигистидиновую последовательность, глутатион S-трансферазу или белок, связывающий мальтозу. Рекомбинантные белки экспрессировали в бактериях и очищали аффинной хроматографией. Агрегатное состояние полученных белков анализировали с помощью аналитической гель-фильтрации. Результаты. Оптимизированы экспрессия, очистка и условия хранения полноразмерного рекомби- нантного His-eEF1Bγ. Также експрессированы и очищены до гомогенного состояния несколько усеченных форм eEF1Bγ. Две укороченные формы С-концевого домена, содержащие аминокис- лотные остатки 263–437 и 228–437, получены в виде растворимых мономерных белков. Две укороченные формы N-концевого домена, содержащие аминокислотные остатки 1–33 и 1–230, слитые с глутатион S-трансферазой, получены в виде димеров по результатам гель-фильтрации. Другие делеционные мутанты, содержащие аминокислотные остатки 1–93 и 1–165 N-концевого домена и слиты с белком, связывающим мальтозу, могут быть получены только в виде растворимых высокомолекулярных агрегатов. Выводы. Получены и охарактеризованы рекомбинантный фактор элонгации трансляции His-eEF1B и его четыре усеченные формы, которые в дальнейшем будут использованы для изу- чения белково-белковых взаимодействий

Structural dissection of human translation elongation factor 1Bγ (eEF1Bγ): expression of full-length protein and its truncated forms

Aim. To gain more insights into properties of the human translation elongation factor eEF1Bγ and its interaction with partners we intended to produce the full-length protein and its truncated forms. Methods. cDNAs encoding truncated forms of eEF1Bγ were generated by PCR amplification with respective primers and cloned into vectors providing polyhistidine, glutathione S-transferase or maltose binding protein tags. The recombinant proteins were expressed in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. An aggregation state of the proteins was analyzed by analytical gel filtration. Results. The expression, purification and storage conditions for the full-length recombinant His-eEF1Bγ were optimized. Several truncated forms of eEF1Bγ were also expressed and purified to homogeneity. Two short variants of C-terminal domain comprising amino acids 263–437 or 228–437 were obtained in monomeric state. Two short variants of N-terminal domain comprising amino acids 1–33 or 1–230, fused with glutathione S-transferase, were obtained and estimated to be dimers by gel filtration. The mutants of N-terminal domain comprising amino acids 1–93 or 1–165, fused with maltose binding protein, were obtained as soluble high molecular weight aggregates only. Conclusions. The purified recombinant His-eEF1Bγ and several truncated forms of the protein were obtained and characterized. These protein variants will be used for further studies on the protein-protein interaction.Мета. Для детального вивчення властивостей фактора елонгації трансляції eEF1Bγ людини і його взаємодії з партнерами оптимізувати експресію кДНК повнорозмірного білка та його вкорочених форм. Методи. кДНК, які кодують вкорочені форми eEF1Bγ, синтезували методом ПЛР-ампліфікації з відповідними праймерами і клонували у вектори, що містять які афінну мітку полігістидинову послідовність, глутатіон S-трансферазу або білок, який зв’язує мальтозу. Рекомбінантні білки експресували в бактеріях і очищували афінною хроматографією. Агрегатний стан отриманих білків аналізували з використанням аналітичної гель-фільтрації. Результати. Оптимізовано експресію, очищення та умови зберігання повнорозмірного рекомбінантного His-eEF1Bγ. Також експресовано і очищено до гомогенного стану кілька вкорочених форм eEF1Bγ. Дві вкорочені форми С-кінцевого домену, які містять амінокислотні залишки 263–437 і 228–437, отримано у вигляді розчинних мономерних білків. Дві вкорочені форми N-кінцевого домену, що містять амінокислотні залишки 1–33 і 1–230, злиті з глутатіон S-трансферазою, одержано у вигляді димерів згідно з результатами гель-фільтрації. Інші делеційні мутанти, які містять амінокислотні залишки 1–93 і 1–165 N-кінцевого домену та злиті з білком, що зв’язує мальтозу, можуть бути отримані лише у вигляді розчинних високомолекулярних агрегатів. Висновки. Отримано і охарактеризовано рекомбінантний білок His-eEF1Bγ та його чотири вкорочені форми. Ці форми в подальшому буде використано для вивчення білково-білкових взаємодій.Цель. Для более детального изучения свойств человеческого фактора элонгации трансляции eEF1Bγ и его взаимодействия с партнерами оптимизировать експрессию кДНК полноразмерного белка, а также его усеченных форм. Методы. кДНК, кодирующие укороченные формы eEF1Bγ, генерировали методом ПЦР-амплификации с соответствующими праймерами и клонировали в векторы, содержащие в качестве аффинной метки полигистидиновую последовательность, глутатион S-трансферазу или белок, связывающий мальтозу. Рекомбинантные белки экспрессировали в бактериях и очищали аффинной хроматографией. Агрегатное состояние полученных белков анализировали с помощью аналитической гель-фильтрации. Результаты. Оптимизированы экспрессия, очистка и условия хранения полноразмерного рекомби- нантного His-eEF1Bγ. Также експрессированы и очищены до гомогенного состояния несколько усеченных форм eEF1Bγ. Две укороченные формы С-концевого домена, содержащие аминокис- лотные остатки 263–437 и 228–437, получены в виде растворимых мономерных белков. Две укороченные формы N-концевого домена, содержащие аминокислотные остатки 1–33 и 1–230, слитые с глутатион S-трансферазой, получены в виде димеров по результатам гель-фильтрации. Другие делеционные мутанты, содержащие аминокислотные остатки 1–93 и 1–165 N-концевого домена и слиты с белком, связывающим мальтозу, могут быть получены только в виде растворимых высокомолекулярных агрегатов. Выводы. Получены и охарактеризованы рекомбинантный фактор элонгации трансляции His-eEF1B и его четыре усеченные формы, которые в дальнейшем будут использованы для изу- чения белково-белковых взаимодействий

The eEF1 family of mammalian translation elongation factors

The eEF1 family of mammalian translation elongation factors is comprised of the two variants of eEF1A (eEF1A1 and eEF1A2), and the eEF1B complex. The latter consists of eEF1Bα, eEF1Bβ, and eEF1Bγ subunits. The two eEF1A variants have similar translation activity but may differ with respect to their secondary, “moonlighting” functions. This variability is underlined by the difference in the spatial organization of eEF1A1 and eEF1A2, and also possibly by the differences in their post-translational modifications. Here, we review the data on the spatial organization and post-translation modifications of eEF1A1 and eEF1A2, and provide examples of their involvement in various processes in addition to translation. We also describe the structural models of eEF1B subunits, their organization in the subcomplexes, and the trimeric model of the entire eEF1B complex. We discuss the functional consequences of such an assembly into a complex as well as the involvement of individual subunits in non-translational processes