Die Rolle von Wollknäuel und Alas während der Hautdifferenzierung bei Drosophila

Insect skin differentiation involves the construction of the extracellular cuticle that is formed by the systematic secretion of its components. To elucidate the importance of initial facets of N-glycosylation during secretion of cuticle material, I investigated the function of the wollknäuel (wol) gene in Drosophila. Wol codes for the Drosophila Alg5 that initiates the glucosylation of the dolichol-linked oligosaccharide destined to be linked to an extracellular or membrane-bound protein. Stepwise reduction of Wol activity leads to gradual worsening of cuticle phenotype. Abrogation of Wol function results in decrease of glucosylation and by consequence lowered amounts of N-glycosylated proteins. For instance, the levels of the cuticle organizing factor Knickkopf (Knk) are reduced, while it continues to be correctly localized to the plasma membrane. Interestingly, at the same time, the polarity determinants Crumbs (Crb, membrane-inserted) and the kinase aPKC (cytosolic) accumulate at the apical plasma membrane in wol deficient embryos. Hence, hypoglucosylation perturbs the balance of epidermal differentiation factors. The observed defects may indirectly be triggered by the unfolded protein response (upr), which is commonly caused by ER stress and reduces transcription and translation in general. In this scenario, there is no simple explanation for the behaviour for Crb and aPKC. Alternatively, glucosylation may be an important checkpoint directly controlling efficient and balanced supply of secreted and membrane-associated proteins during epidermal differentiation. An essential function of the arthropod cuticle is to guard the animal against dehydration. To understand the molecular mechanism of water retention capacity of the insect cuticle, I studied the consequences of a P-element insertion in the gene CG3017 that causes liquid barrier defects. CG3017 codes for the rate limiting enzyme delta-aminolevulenic acid synthase (Alas) catalyzing the initial step in heme biosynthesis. Consistently, mutations in alas reduce the heme content, which has several cellular consequences including higher double phosphorylated ERK levels and increased phosphorylation of eIF2alpha that results in attenuated translation, which could explain the reduced levels of Knk and cytochrome C. At the ultrastructural level, alas mutants show rupturing of procuticle especially at its basal side, a phenotype that is similar to the Dualoxidase (Duox) mutant cuticle phenotype in C. elegans. Duox is a heme binding enzyme that catalyzes the cross-linking of tyrosine residues involved in the stabilization of cuticular extracellular matrix. Indeed, dityrosine cross-links are reduced in the alas mutant cuticle. By contrast, the septate junctions that are known as physical barriers in epithelia and transglutaminase function that is known for water barrier function in vertebrates are normal in alas mutant. Taken together, I show a previously not identified function for the dityrosine protein cross-link in the insect cuticle that is required as a physical barrier for water retention.Während der Differenzierung der Insektenhaut wird die extrazelluläre Kutikula durch die geordnete Sekretion ihrer Komponenten gebildet. Zur Aufklärung der Bedeutung der frühen N-Glykosylierung bei der Sekretion von Kutikulamaterial untersuchte ich in meinem ersten Projekt die Funktion des Wollknäuel(wol)-Gens in der Taufliege Drosophila melanogaster. Das wol-Gen kodiert für das Drosophila Alg5-Enzym, das die Glukosylierung des Dolicholgebundenen Oligosaccharids initiiert, das während der N-Glykosylierung an ein extrazelluläres oder Membran-gebundenes Protein angehängt wird. Die stufenweise Reduktion von Wol-Aktivität führt zur Schrittweisen Verschlechterung des Kutikula-Phänotyps. Die Aufhebung der Wol-Funktion führt zu verringertem Glukosylierungsgrad und folglich reduzierten Mengen an N-glykosylierten Proteinen. Zum Beispiel sind die Pegel des Kutikula-organisierenden Faktors Knickkopf (Knk) reduziert, während es richtig zur Plasmamembran lokalisiert wird. Interessanterweise akkumulieren gleichzeitig die Zellpolaritätsdeterminanten Crumbs (Crb, membranär) und atypische Proteinkinase (aPKC, cytosolisch) an der apikalen Plasmamembran in Wol defizienten Larven. Ich folgere, dass die Hypoglukosylierung das Gleichgewicht der epidermalen Differenzierungsfaktoren stört. Die beobachteten Defekte können indirekt ausgelöst sein durch die so genannte „unfolded protein response" (UPR), die üblicherweise durch ER-Stress verursacht wird und zur Reduktion der Transkription und Translation im Allgemeinen führt. In diesem Szenario gibt es keine einfache Erklärung für das Verhalten für Crb und aPKC. Alternativ nehmen wir an, dass die Glukosylierung ein wichtiger direkter Kontrollpunkt für effiziente und ausgewogene Versorgung der epidermalen Differenzierung mit sekretierten und membranassoziierten Proteinen sein könnte. Eine wesentliche Aufgabe der Arthropoden Kutikula ist, das Tier vor dem Austrocknen zu schützen. Zum besseren Verständnis der molekularen Mechanismen des Wasserrückhaltevermögens der Insektenkutikula studierte ich in meinem zweiten Projekt die Folgen einer P-Element Insertion in das Gen CG3017, die Barriere-Defekte der Kutikula verursacht. CG3017 kodiert für das Enzym delta-Aminolevulinat-Synthase (Alas), das den erstenSchritt der Häm-Biosynthese katalysiert. Mutationen in alas führen zu einer Verringerung des Häm-Gehalts, was unter anderem erhöhte Phosphorylierung des Signaltransduktionsfaktors ERK und des Translationsinitiationsfaktors eIF2alpha zur Folge hat. Überphosphorylierung von eIF2alpha führt zur Verlangsamung der Translation, was die Reduktion an Knk und Cytochrom c erklären könnte. Auf der ultrastrukturellen Ebene zeigen alas Mutanten eine Zerfransung der Prokutikula besonders an ihrer basalen Seite, was zur Ablösung der Kutikula führt, ein Phänotyp, der dem ähnelt, der durch Reduktion der Dualoxidase (Duox)-Aktivität in dem Fadenwurm C. elegans hervorgerufen wird. Duox ist ein Häm-bindendes Enzym, das zur Stabilisierung der extrazellulären Matrix die Vernetzung von Tyrosinresten von kutikulären Proteinen katalysiert. Tatsächlich ist die Dityrosin-Vernetzung in alas-mutanten Larven reduziert. Im Gegensatz dazu sind die parazellulären Zellkontakte, die als eine physikalische Barriere in Epithelien wirken und die Transglutaminase-kontrollierte Vernetzung von extrazellulären Proteinen in der Haut von alas Mutanten normal. Zusammengenommen konnte ich eine bisher nicht identifizierte Funktion für die Dityrosin-Protein-Vernetzung in der Insektenkutikula zeigen, die als eine physikalische transzelluläre Barriere gegen Austrocknung erforderlich ist

THE KNICKKOPF DOMON DOMAIN IS ESSENTIAL FOR CUTICLE DIFFERENTIATION IN Drosophila melanogaster

The dopamine monoxygenase N-terminal (DOMON) domain is found in extracellular proteins across several eukaryotic and prokaryotic taxa. It has been proposed that this domain binds to heme or sugar moieties. Here, we have analyzed the role of four highly conserved amino acids in the DOMON domain of the Drosophila melanogaster Knickkopf protein that is inserted into the apical plasma membrane and assists extracellular chitin organization. In principal, we generated Knickkopf versions with exchanged residues tryptophan(299,) methionine(333), arginine(401), or histidine(437), and scored for the ability of the respective engineered protein to normalize the knickkopf mutant phenotype. Our results confirm the absolute necessity of tryptophan(299,) methionine(333), and histidine(437) for Knickkopf function and stability, the latter two being predicted to be critical for heme binding. In contrast, arginine(401) is required for full efficiency of Knickkopf activity. Taken together, our genetic data support the prediction of these residues to mediate the function of Knickkopf during cuticle differentiation in insects. Hence, the DOMON domain is apparently an essential factor contributing to the construction of polysaccharide-based extracellular matrices

The putative C-type lectin Schlaff ensures epidermal barrier compactness in Drosophila

Abstract The stability of extracellular matrices is in general ensured by cross-linking of its components. Previously, we had shown that the integrity of the layered Drosophila cuticle relies on the presence of a covalent cuticular dityrosine network. Production and composition of this structure remained unstudied. In this work, we present our analyses of the schlaff (slf) gene coding for a putative C-type lectin that is needed for the adhesion between the horizontal cuticle layers. The Slf protein mainly localizes between the two layers called epicuticle and procuticle that separate from each other when the function of Slf is reduced or eliminated paralleling the phenotype of a cuticle with reduced extracellular dityrosine. Localisation of the dityrosinylated protein Resilin to the epicuticle-procuticle interface suggests that the dityrosine network mediates the adhesion of the epicuticle to the procuticle. Ultimately, compromised Slf function is associated with massive water loss. In summary, we propose that Slf is implied in the stabilisation of a dityrosine layer especially between the epicuticle and the procuticle that in turn constitutes an outward barrier against uncontrolled water flow