Estudio de la interacción entre las proteínas Fur de Anabaena sp. PCC7120

La regulación transcripcional permite a los seres vivos adaptar su expresión génica en respuesta a diferentes señales ambientales. La superfamilia de proteínas bacterianas FUR constituye un grupo de reguladores transcripcionales implicados en procesos como la homeostasis de metales o la defensa redox, incluyendo proteínas como Fur (regulador de la homeostasis de hierro), Zur (regulador de la homeostasis de cinc) y PerR (regulador de la respuesta a estrés por peróxido). La cianobacteria modelo Anabaena sp. PCC7120 presenta tres parálogos FUR, vitales en su regulación transcripcional: FurA (homólogo Fur), FurB (homólogo Zur) y FurC (posible homólogo PerR). Aunque cada una ejerce una acción individual, previamente se había descrito una interregulación de su expresión y la interacción in vitro de FurC tanto con FurA como con FurB.En este trabajo se ha avanzado en la caracterización de la interacción entre las proteínas Fur de Anabaena sp. PCC7120, comenzando por su análisis in vivo en diversas condiciones por ensayos de doble híbrido. Los resultados indican que FurB y FurC interaccionan in vivo en ciertas condiciones, independientemente del estado redox. En cambio, no se ha observado interacción in vivo entre FurA y FurC en las condiciones ensayadas.También se ha estudiado el efecto de la adición de cloruro sódico sobre la interacción in vitro por calorimetría de titulación isotérmica, observándose una reducción de su afinidad tanto para FurC/FurA como para FurC/FurB, lo que sugeriría una posible implicación de fuerzas electrostáticas en estas interacciones. Finalmente, estudios de dicroísmo circular han permitido evaluar la alteración estructural de estas proteínas al interaccionar, observándose cambios conformacionales hacia un mayor contenido en arrollamientos de α-hélices<br /

Estudio de la degradación de isómeros de lindano en muestras complejas procedentes de Bailín

La contaminación por hexacicloclorohexanos (HCH), entre los que destaca el lindano, constituye actualmente un problema de contaminación ambiental de afectación global que presenta uno de sus máximos focos de contaminación en el municipio aragonés de Sabiñánigo. La degradación por microorganismos se ha propuesto como una solución potencial, ya que se ha descrito que ciertos microrganismos son capaces de degradarlo. En este trabajo se llevó a cabo un estudio tanto de la afectación como de la tasa de degradación de la cianobacteria Anabaena PCC7120 ante la presencia de distintas concentraciones de distintos isómeros (alfa-HCH, gamma-HCH (lindano) y mezcla turca de isómeros de HCHs). El crecimiento de Anabaena PCC7120 y el contenido en clorofila a no se vieron afectados en presencia de los isómeros alfa y gamma pero sí en presencia de la mezcla de isómeros. Anabaena PCC7120 fue capaz de degradar prácticamente la totalidad del isómero gamma (lindano) en una semana en las concentraciones estudiadas; y el 50% del isómero alfa. Adicionalmente, el estudio de la variación de la expresión génica indicó que los genes linB y linE de Anabaena PCC7120 se encontraban ligeramente inducidos en presencia del isómero gamma pero no en el alfa. Finalmente, se llevó a cabo un estudio de los cambios en la expresión de los genes nirA y prxA, relacionados con la asimilación de nitrato y con el estrés oxidativo, respectivamente, en presencia de isómero alfa y gamma. El gen nirA no presentó cambios significativos pero el gen prxA presentó una inducción en presencia de ambos isómeros

Estudio de la respuesta a g-lindano en cianobacterias: cambios transcripcionales de genes potencialmente implicados

El lindano es un pesticida organoclorado con gran persistencia en los ecosistemas y con consecuencias graves para la salud humana y el ambiente debido a su bioacumulación. El isómero comúnmente utilizado es el isómero gamma. En Aragón actualmente hay un grave problema de contaminación en la zona de Sabiñánigo debido a la actividad años atrás de la fábrica Inquinosa, que no almacenó de forma correcta los residuos. Los vertederos de Sardás y Bailín (en los que se almacenaron los residuos) están próximos al río Gállego en el que se ha encontrado frecuentemente niveles del pesticida por encima de los permitidos por la legislación vigente. En este trabajo se ha llevado a cabo el estudio de la expresión génica de distintos genes potencialmente implicados en la respuesta de dos cianobacterias al γ-lindano. Los resultados obtenidos indican que Anabaena PCC7120 tolera bien la presencia de lindano a tiempos cortos, ya que los datos de crecimiento, el contenido de clorofila a y el contenido de proteínas indican solo una ligera afectación. Por otra parte, se ha demostrado que el lindano produce estrés oxidativo a los organismos de estudio (Anabaena y Microcystis aeruginosa PCC7806) mostrando un aumento en la expresión de genes que se inducen como respuesta al estrés oxidativo (furC y prxA). La ruta de degradación de lindano en Anabaena se desconoce. En este trabajo se han relacionado genes que codifican para enzimas presentes en la ruta de degradación de Sphingomonas paucimobilis con genes presentes en el genoma de Anabaena, los cuales podrían corresponder con los homólogos de la ruta de degradación en Anabaena. Además, se ha utilizado una cepa con sobreexpresión de un regulador transcripcional, furC, que nos ha permitido observar que la sobreexpresión de esta proteína le confiere a la cianobacteria un aumento de la tolerancia al pesticida con respecto a la cepa silvestre

Papel de FurC en la defensa de Anabaena PCC7120 frente a estrés oxidativo

Las proteínas Fur son una familia de reguladores transcripcionales presente en un amplio rango de bacterias y cianobacterias. En la cianobacteria Anabaena PCC7120, se han identificado tres parálogos de esta familia denominados FurA, FurB y FurC. Mientras FurA y FurB tienen funciones bastante bien definidas, la función de FurC todavía se desconoce en detalle. Trabajos previos en nuestro laboratorio revelaron que FurC modulaba la autorregulación de FurA y FurB in vitro. Recientemente, la fuerte inducción de la expresión de FurC en condiciones de estrés oxidativo y su mecanismo de acción han llevado a proponerlo como el regulador de peróxido de hidrógeno (PerR) de Anabaena PCC7120. En el presente estudio, hemos analizado los efectos de la sobreexpresión de FurC en el fenotipo y el perfil transcripcional de Anabaena PCC7120 para aportar nueva información sobre la función FurC. En primer lugar se observó que los elevados niveles de FurC provocaban una mayor sensibilidad al estrés producido por peroxido de hidrógeno o metil viológeno. Ensayos bioquímicos adicionales revelaron una reducción de la actividad superóxido dismutasa y catalasa, entre otras alteraciones fisiológicas. Además, se determinó la expresión de genes clave en la respuesta a estrés. Nuestros datos revelaron una alteración del patrón de expresión en respuesta a estrés de los genes sodA, alr0998 y prxA, sugiriendo que FurC era capaz de regularlos directa o indirectamente. Sin embargo, solo el promotor de prxA se describió como diana directa de FurC. Previamente se había descrito que FurB era capaz de unirse a los promotores de sodA y alr0998, regulando su transcripción. En este contexto, incubamos FurC y FurB conjuntamente en un ensayo EMSA cuyos resultados sugirieron una posible interacción entre estas dos proteínas que podría indicar una coordinación de la homeostasis del zinc y el estrés oxidativo

Nuevas funciones de las proteínas Fur en el metabolismo del nitrógeno de Anabaena PCC7120 y su posible actuación como sensores del balance carbono/nitrógeno

Las proteínas FUR (Ferric Uptake Regulator) son reguladores transcripcionales que controlan la homeostasis de metales y están presentes en la mayoría de organismos procariotas. Sin embargo en cianobacterias se piensa que tienen una función más global y controlan otros procesos, como por ejemplo el metabolismo del nitrógeno. Anabaena PCC7120 es una cianobacteria filamentosa capaz de fijar nitrógeno atmosférico que presenta tres parálogos de proteínas FUR, FurA, FurB y FurC. Estudios previos mostraron que FurA estaba implicada en la diferenciación de heterocistos, células especializadas en la fijación de nitrógeno, y sugerían que FurC también podría desempeñar algún papel en la regulación del metabolismo del nitrógeno.En este trabajo se ha analizado el transcriptoma de una estirpe de sobreexpresión de FurC en deficiencia de nitrógeno y se ha estudiado su morfología y fisiología en esas condiciones. Los resultados obtenidos muestran que la sobreexpresión de este regulador transcripcional impide la formación de heterocistos y que FurC regula directamente la expresión de genes implicados en la asimilación de fuentes de nitrógeno y la diferenciación de heterocistos. Además, dado que en cianobacterias el 2-oxoglutarato actúa como molécula señalizadora del balance carbono/nitrógeno, también se ha estudiado si FurA y FurC eran capaces de actuar como sensores de este metabolito. Se ha determinado que ambas proteínas son capaces de unirse a este compuesto lo que postula a ambas proteínas como potenciales sensores del balance carbono/nitrógeno. Además en el caso de FurA esta interacción modula su actividad de unión al DNA. Los resultados obtenidos en este trabajo confirman que las proteínas FUR son reguladores globales en la cianobacteria Anabaena PCC7120, con implicaciones importantes en la regulación del metabolismo del nitrógeno y la formación de heterocistos.<br /

Análisis de la interacción entre proteínas Fur de Anabaena PCC7120: influencia en su actividad biológica y presencia de hetero-oligómeros in vivo

La cianobacteria filamentosa Anabaena PCC7120 presenta tres proteínas de la familia de reguladores transcripcionales procariotas FUR (Ferric Uptake Regulator): FurA, FurB y FurC. Estudios previos indicaban que estas proteínas podrían estar interaccionando entre sí. Aunque la interacción entre reguladores transcripcionales no es un mecanismo regulatorio generalizado en procariotas, en la bibliografía se encuentran varios ejemplos de cómo puede afectar a la expresión génica. En el presente trabajo se ha analizado el efecto de FurC sobre la función como regulador transcripcional de FurB, y viceversa, mediante ensayos de retardo en gel. Los resultados indicaron que la presencia de FurB llevaba a una unión potenciada de FurC al promotor de hetZ, sugiriendo un efecto sobre la función de FurC. Por otro lado, se ha estudiado la presencia de hetero-oligómeros FurC/FurB in vivo en Anabaena PCC7120. Sin embargo, los resultados obtenidos no han permitido observar dichos hetero-oligómeros, sugiriendo que o bien no interaccionan en las condiciones de cultivo o, lo que es más probable, que su interacción es inestable o transitoria. Sorprendentemente, se ha detectado una alta presencia de FurB en membranas con una masa molecular superior a la esperada, lo que sugiere que podría estar unida a la membrana mediante un polipéptido. En vista de que estudios previos localizan algunas proteínas Fur en membrana y que éstas pueden ser proteolizadas mediante proteínas FtsH, se planteó la posibilidad de que este mecanismo se aplique a FurB. Análisis bioinformáticos realizados en este trabajo han permitido identificar en Anabaena PCC7120 cuatro homólogos a las cuatro proteasas FtsH de la cianobacteria Synechocystis PCC6803, incluyendo un posible ortólogo FtsH3, proteína implicada en la proteólisis de Fur, ortólogo de FurA de Anabaena PCC7120 en Synechocystis PCC6803<br /

Caracterización de la cianobacteria Anabaena PCC7120 como potencial biorremediador de lindano: respuesta fisiológica y transcripcional y aplicación a muestras de campo

La contaminación por hexaclorociclohexanos (HCH) constituye un problema de salud ambiental a escala mundial. Uno de los lugares más contaminados está en el Pirineo aragonés, en el municipio de Sabiñánigo (Huesca). La degradación de estos compuestos por microorganismos se plantea como una posible solución al problema, debido a que se han descrito cepas capaces de degradar el compuesto. Una de ellas es Anabaena PCC7120, que es capaz de degradar al menos el isómero -HCH (lindano). En este trabajo se ha caracterizado fisiológicamente la respuesta del microorganismo a la presencia del lindano mediante el estudio de la afectación morfológica de sus células, la tasa de fotosíntesis y respiración y su respuesta a estrés oxidativo. Se han determinado para ello la variación en la expresión de algunas actividades enzimas de respuesta a estrés oxidativo además de las inducción de proteínas Fur y flavodoxina. Se ha observado un aumento en la actividad catalasa y una disminución en la actividad diaforasa de la proteína FNR, además de una sobreexpresión de las proteínas FurA y FurB, ambas asociadas a la presencia de estrés oxidativo. Por otro lado, se ha estudiado la inducción de la expresión de los genes lin potencialmente implicados en la ruta de degradación de lindano y se ha evaluado la tasa de degradación utilizando un método de inmovilización basado en perlas de alginato. Se concluye que Anabaena PCC7120 inmovilizada en perlas de alginato es capaz de degradar un 60% del lindano en 6 días. En último lugar, se ha puesto a punto un método para detectar la presencia de los genes lin en muestras de agua potencialmente contaminada con lindano

Redes de regulación global mediadas por proteínas FUR en Anabaena sp. PCC7120

Las cianobacterias son organismos muy ubicuos que se encuentran ampliamente distribuidos por todo el planeta, ocupando ambientes muy diversos en los que deben enfrentarse a diferentes estreses abióticos. Uno de los principales mecanismos que permite a las cianobacterias adaptarse a estos estreses es la regulación de la expresión génica, que principalmente es llevada a cabo por reguladores transcripcionales y sistemas de dos componentes. En la cianobacteria Anabaena sp. PCC7120 una de las familias de reguladores transcripcionales más importantes es la familia FUR, compuesta por tres parálogos denominados FurA, FurB y FurC. Estos tres factores de transcripción son esenciales para orquestar las respuestas de esta cianobacteria a estreses abióticos y son reguladores globales que modulan la expresión de una gran número de genes en el genoma de Anabaena sp. PCC7120. Algunos de estos genes están regulados de forma directa pero muchos otros están regulados indirectamente a través de reguladores transcripcionales o sistemas de dos componentes que se encuentran jerárquicamente por debajo de estas proteínas. En este trabajo, con el objetivo de identificar redes de regulación global mediadas por proteínas FUR, se ha analizado la capacidad de FurA, FurB y FurC de regular de forma directa genes de reguladores transcripcionales y sistemas de dos componentes mediante ensayos de retardo en gel (EMSA). Además, también se ha estudiado transcripcionalmente la respuesta a la deficiencia de nitrógeno y al estrés oxidativo de algunas proteínas con funciones reguladoras controladas por FurC. Así, se han identificado redes de regulación transcripcional mediadas por proteínas FUR en Anabaena sp. PCC7120 que podrían jugar un papel clave en la respuesta de esta cianobacteria a los estreses abióticos.<br /

Estudio del perfil metabólico y la presencia de genes lin en comunidades microbianas de suelos contaminados por lindano

El lindano es el isómero γ del hexaclorociclohexano (HCH), producto de su fabricación de mediante la fotocloración del benceno, proceso en el que se generan cuatro isómeros más (α-HCH, β-HCH, δ-HCH, y ε-HCH). El elevado uso del Lindano como pesticida de uso agrícola durante las últimas 6 décadas ha generado graves problemas medioambientales derivados de su toxicidad y permanencia en el medio ambiente. Concretamente, en la localidad de Sabiñánigo (Huesca), las actividades de INQUINOSA, fábrica productora de este pesticida, provocaron la acumulación desregulada de desechos de fabricación del HCH en diferentes zonas de la periferia de la localidad: verteros de Sardas, Bailín, y las propias inmediaciones de la fábrica. Estudios realizados por el Instituto Pirenaico de Ecología (IPE-CSIC) revelaron la capacidad de las poblaciones microbianas en tierras localizadas en estos emplazamientos contaminados con lindano, de tolerar e incluso degradar isómeros del HCH, mayoritariamente el γ-HCH. Dichas tierras, fueron proporcionadas para este estudio, con el objetivo de caracterizar las poblaciones metabólicamente y buscar en ellas genes, mediante el diseño de oligos para la técnica de PCR, correspondientes a la ruta de degradación lin descrita en Sphingomonaceas y otros géneros bacterianos comunes de suelos. Los resultados muestran que las poblaciones muestreadas han permanecido metabólicamente activas. Sin embargo, no se han encontrado dichos genes correspondientes a la ruta estudiada, indicativo de que o bien los microorganismos modelo para el diseño de los oligos no están presentes en estas tierras, los genes lin buscados no presentan homología con los estudiados o las poblaciones bacterianas de estos suelos degradan por una ruta diferente a la lin descrita. <br /

Degradación de isómeros del hexaclorociclohexano (HCH) por Anabaena PCC7120

El hexaclorociclohexano (HCH) fue ampliamente utilizado como pesticida entre 1930 y 1990 e inicialmente se aplicó como una mezcla técnica que contenía α-HCH (60-70%), β-HCH (5-12%), γ-HCH (10-15%) y δ-HCH (6-10%). Se sintetizaba por fotocloración del benceno, proceso en el cual se formaban los isómeros anteriores, aunque posteriormente solamente el isómero γ-HCH o lindano se comercializó, por ser el más efectivo y relativamente más biodegradable. Dado que este isómero constituía solo un 10-15% del total de isómeros, el resto eran enterrados o acumulados en vertederos, lo que ha generado zonas altamente contaminadas en distintos puntos del planeta. Aunque el HCH es persistente y recalcitrante se han aislado algunos microorganismos capaces de degradar uno o más isómeros del HCH. Uno de ellos es Anabaena PCC7120, una cianobacteria filamentosa capaz de degradar lindano (γ-HCH). En este trabajo se ha analizado su tolerancia y respuestas fisiológicas en presencia de los isómeros α-HCH, β-HCH, γ-HCH y δ-HCH. También se ha estudiado su capacidad degradativa, midiendo la desaparición de los distintos isómeros en cultivos de Anabaena PCC7120. Los resultados muestran que es un organismo adecuado para plantear biorremediación de los isómeros α-HCH y γ-HCH, que prácticamente desaparecen por completo. Sin embargo los isómeros β-HCH y δ-HCH no son eliminados en su totalidad y son peor tolerados en las concentraciones utilizadas, afectando notablemente al crecimiento y fisiología de las cianobacterias. Finalmente se ha estudiado la expresión de genes potencialmente implicados en la degradación de HCH y se han realizado estudios in silico para encontrar otros genes involucrados, sugiriendo la existencia de una ruta alternativa a la de microorganismos heterótrofos como S. paucimobilis