İnsan İnsülin Hormonu Öncülerinin Pichia pastoris AOX1 Promotoru Altında Klonlanması, Ekspresyonu ve Biyoreaktörde Üretimi

İnsülin pankreasın beta hücrelerinden üretilen ve vücutta glukoz dengesini sağlayan önemli bir peptit hormondur. Pankreasın yeterli miktarda insülin üretememesi ya da hücrelerin üretilen insüline cevap verememesi sonucu kan glukoz düzeyinin yükselmesiyle diyabet adı verilen metabolik bir hastalık meydana gelir. Günümüzde bu hastalığın tedavisinde insülin hormonu kullanılmaktadır. İnsülin hormonu genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak rekombinant olarak üretilen ilk proteindir. İlk olarak Escherichia coli ve Saccharomyces cerevisiae’da üretilmeye başlanmış, ancak son zamanlarda rekombinant insülin üretiminde Pichia pastoris (Komagataella phaffi) ’in  kullanımı yaygınlaşmıştır. Bu çalışmada, insan insülin hormonu öncülerinin (IP) P. pastoris’in metanol ile indüklenebilir AOX1 promotoru altında üretimini sağlamak amacıyla; bu proteini kodlayan DNA fragmenti transformasyon ve ligasyon gibi moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak plazmide aktarılarak istenen proteini kodlayan bir ekspresyon vektörü elde edilmiştir. Ekspresyon vektörünün lityum asetat yöntemiyle yetenekli hale getirilen P. pastoris X33 suşuna elektroporasyonla transferi sağlanmıştır. 5L ölçekli biyoreaktörde yapılan protein ekspresyonu çalışması sonrasında alınan örnekler SDS-PAGE ve ELISA yöntemleriyle analiz edilmiş ve 7.5 mg/L IP proteini üretildiği tespit edilmiştir

Process development for an effective COVID-19 vaccine candidate harboring recombinant SARS-CoV-2 delta plus receptor binding domain produced by Pichia pastoris

Abstract Recombinant protein-based SARS-CoV-2 vaccines are needed to fill the vaccine equity gap. Because protein-subunit based vaccines are easier and cheaper to produce and do not require special storage/transportation conditions, they are suitable for low-/middle-income countries. Here, we report our vaccine development studies with the receptor binding domain of the SARS-CoV-2 Delta Plus strain (RBD-DP) which caused increased hospitalizations compared to other variants. First, we expressed RBD-DP in the Pichia pastoris yeast system and upscaled it to a 5-L fermenter for production. After three-step purification, we obtained RBD-DP with > 95% purity from a protein yield of > 1 g/L of supernatant. Several biophysical and biochemical characterizations were performed to confirm its identity, stability, and functionality. Then, it was formulated in different contents with Alum and CpG for mice immunization. After three doses of immunization, IgG titers from sera reached to > 106 and most importantly it showed high T-cell responses which are required for an effective vaccine to prevent severe COVID-19 disease. A live neutralization test was performed with both the Wuhan strain (B.1.1.7) and Delta strain (B.1.617.2) and it showed high neutralization antibody content for both strains. A challenge study with SARS-CoV-2 infected K18-hACE2 transgenic mice showed good immunoprotective activity with no viruses in the lungs and no lung inflammation for all immunized mice