Regulación de la producción del Exopolisacárido en Sinorhizobium fredii HH103, un simbionte de la soja y otras leguminosas.

Los rizobios son bacterias del suelo pertenecientes a las clases α- y β-Proteobacteria y que son capaces de llevar a cabo la fijación biológica del nitrógeno molecular en simbiosis con plantas leguminosas (Spaink et al., 1998; Suzaki et al., 2015) En esta relación, los rizobios inducen la formación de nuevos órganos llamados nódulos donde se diferencian a bacteroides, el estado capaz de fijar nitrógeno. Durante el proceso simbiótico tiene lugar un complejo diálogo molecular entre la planta y la bacteria, necesario para la infección de las raíces de la planta y la invasión de los nódulos formados por la planta. Los rizobios se encuadran en diferentes géneros de bacterias, siendo los más estudiados Rhizobium, Sinorhizobium (actualmente denominado Ensifer; Willems, 2006), Bradyrhizobium y Mesorhizobium, todos ellos pertenecientes a la clase α-Proteobacteria. Entre las leguminosas noduladas por los rizobios, se pueden encontrar varios e importantes plantas agrícolas como soja, judía y cowpea. La soja (Glycine max) es la leguminosa más importante agronómicamente a nivel mundial ya que se puede emplear para múltiples usos como alimento humano y animal, obtención de aceites vegetales a partir de sus semillas así como de productos “nutracéuticos” (beneficiosos para la salud) como isoflavonas, soponinas o fitoesteroles. La soja puede ser nodulada por estirpes de diferentes especies que pertenecen a los géneros Sinorhizobium, Mesorhizobium y Bradyrhizobium (Margaret et al., 2011; Rodríguez-Navarro et al., 2011), que a su vez pueden diferenciarse en función de su tasa de crecimiento (desde rizobios de crecimiento rápido a lento, respectivamente). S. fredii es una especie descubierta en China en 1985, y fue el primer rizobio de crecimiento rápido que incluía estirpes capaces de nodular soja. Las estirpes de S. fredii son capaces de nodular un alto número de leguminosas, pero muestran diferencias en su capacidad de nodular diferentes variedades de soja. De hecho, las tres estirpes más estudiadas hasta ahora difieren en esta característica: S. fredii NGR234 no es capaz de nodular soja, S. fredii USDA257 nódula variedades asiáticas de soja, pero es inefectivo con variedades americanas, y S. fredii HH103 es capaz de nódular ambos cultivares de soja, asiáticos y americanos. La simbiosis requiere un coordinado intercambio de señales entre la planta y el rizobio, y sólo cuando ambos simbiontes son compatibles, tiene lugar el proceso de nodulación (Downie, 2007; López-Baena et al., 2016). Este proceso comienza con la secreción, por parte de la planta, de un grupo de compuestos fenólicos llamados flavonoides que interaccionan con un regulador transcripcional bacteriano de tipo LysR, NodD. Sólo los flavonoides compatibles son capaces de activar este regulador. Por lo tanto, este paso establece una barrera de especificidad simbiótica para seleccionar sólo los simbiontes compatibles. Posteriormente, NodD activa la expresión de genes mediante su unión a secuencias específicas y conservadas de ADN localizas aguas arriba de estos genes y denominadas nod boxes (NB). Uno de los grupos de genes activados por NodD son aquellos (genes nod) responsables de la síntesis de los factores Nod (NF). Los NF son moléculas de lipo-quito-oligosacáridos compuestas de 2 a 6 residuos de N-acetil-glucosamina unida por enlaces β-1,4. El residuo de N-acetil-glucosamina localizado en el extremo no reductor se encuentra acilado por un ácido graso. Los NF pueden estar decorados con diferentes tipos de sustituciones (grupos fucosilos, metilos, sulfatos y acetilos) y ácidos grasos. Los NF se detectan por parte de la planta a través de los receptores de los NF (NFRs) localizados en las membranas de los pelos radicales. Este paso establece otra barrera simbiótica ya que el reconocimiento de los NF apropiados promueve la infección bacteriana y el inicio del desarrollo nodular. En caso positivo, el reconocimiento de los NF provoca una oscilación de la concentración de calcio dentro de los pelos radicales que, a través de una cascada de señalización, provoca diferentes respuestas, principalmente la curvatura del pelo radical (atrapando la población de rizobios) y formación de primordios nodulares. Posteriormente, la bacteria penetra dentro del pelo radical a través de unas estructuras tubulares llamados tubos de infección y eventualmente se liberan a células vegetales poliploides localizadas dentro de los nódulos. Dentro de estas células, las bacterias se diferencian en bacteroides y llevan a cabo la fijación de nitrógeno. Además de la infección a través de pelos radicales, existe otro método de infección llamado crack entry, donde la bacteria entra en las raíces a través de heridas en la superficie radical. Además de los NF, hay otras señales bacterianas que juegan papeles clave en la interacción simbiótica (Downie, 2010; López-Baena et al., 2016). Estas señales incluyen proteínas efectoras (llamadas Nops, nodulation outer protein), que se liberan al interior de las células hospedadoras a través del sistema de secreción de tipo III, y polisacáridos superficiales. En cuanto a los polisacáridos superficiales, los principales involucrados en simbiosis son los lipopolisacáridos (LPS) y los polisacáridos capsulares (KPS), los cuales se anclan a la membrana externa, los glucanos cíclicos (GC), localizados en el espacio periplásmico, y lo exopolisacáridos (EPS), que se liberan al medio extracelular o están débilmente unido a la superficie bacteriana. Se piensa que las Nops y los polisacáridos superficiales tienen papeles importantes en la interacción simbiótica como la disminución de la respuesta defensiva de la planta y/o actuando como señal simbiótica que se requiere a lo largo de las diferentes etapas del proceso de nodulación. Nuestro grupo de investigación ha trabajado en el estudio de la interacción simbiótica de S. fredii HH103 con diferentes plantas hospedadoras, incluyendo soja, desde hace más de 30 años (Margaret et al., 2011; López-Baena et al., 2016). Recientemente, hemos secuenciado el genoma de HH103 (Vinardell et al., 2015), compuesto por el cromosoma (4,3 Mb) y seis plásmidos, los cuales se nombran con una letra en función del tamaño del plásmido, pSfhh103a1 (~24 Kb), pSfhh103a2 (~25 Kb), pSfhh103b (~62 Kb), pSfhh103c (~144 Kb), pSfhh103d (~589 Kb) y pSfhh103e (~2,1 Mb). Durante los últimos 15 años, nuestro grupo ha estudiado los diferentes polisacáridos superficiales centrándose en sus estructuras, su relevancia simbiótica con diferentes plantas hospedadoras y la regulación de su producción. El principal objetivo de esta tesis era profundizar en la investigación de algunos aspectos específicos de los polisacáridos superficiales de S. fredii HH103. Específicamente, los objetivos concretos de esta tesis eran: 1. Caracterizar la región genética rkp-2 de S. fredii HH103 y estudiar su implicación en la producción de diferentes polisacáridos superficiales. 2. Estudiar la relevancia de los diferentes polisacáridos superficiales de S. fredii HH103 en su interacción simbiótica con la leguminosa modelo Lotus. 3. Estudiar la regulación de la producción de EPS mediada por flavonoides en S. fredii HH103. 4. Caracterizar los genes mucR1 y mucR2 de S. fredii HH103 y estudiar su papel regulador sobre los genes involucrados en la producción de EPS. Objetivo 1. Los resultados presentados en el correspondiente capítulo han sido publicados en Plant and Soil (Acosta-Jurado et al., 2017. Plant and Soil. Doi:10.1007/s11104-017-3268-z). En S. meliloti Rm41, los genes relacionados con la producción de KPS se distribuyen entre tres regiones genéticas (López-Baena et al., 2016), rkp-1, involucrada en la síntesis del lípido transportador del KPS, rkp-3, implicada en el transporte y síntesis de la subunidad de repetición del KPS, y rkp-2, compuesto por dos genes cuyos productos son responsables de la producción de ácido UDP-galacturónico desde el ácido UDP-glucurónico, catalizado por LpsL, y ácido UDP-glucurónico desde UDP-glucosa, catalizado por RkpK. Ambos genes se requieren para la producción de LPS, y rkpK también es necesario para la biosíntesis de KPS debido a la presencia de ácido glucurónico en este polisacárido. Estas tres regiones también están presentes en S. fredii HH103. En trabajos anteriores, nuestro grupo de investigación ha llevado a cabo los estudios de las regiones rkp-2 y rkp-2 y ha demostrado su implicación en la producción de KPS, así como la de la región rkp-3 en la síntesis de LPS. En esta tesis, hemos investigado la implicación de la región rkp-2 en la producción de los polisacáridos superficiales de HH103. En este trabajo, hemos demostrado que los genes lpsL y rkpK de S. fredii HH103 no forman una unidad transcripcional y que la tasa de transcripción de rkpK es mucho mayor que la de lpsL. Los experimentos de PAGE mostraron que la inactivación de cada uno de estos genes dio lugar a alteraciones en el LPS, pero no afectó a la producción de KPS (confirmado por H-NMR), lo cual está en consonancia con la ausencia de ácidos urónicos en este polisacárido en S. fredii HH103. La mutación de rkpK también tuvo impacto sobre la producción del exopolisacárido (EPS), probablemente por la presencia de ácido glucurónico en este polisacárido. El aspecto sobre placas de YMA, cuantificación de los equivalentes de glucosa en medio YM y los experimentos de H-RMN confirmaron que la inactivación de rkpK no provoca una alteración del EPS sino una incapacidad para producir este polisacárido, sugiriendo que la disponibilidad de ácido glucurónico es esencial para la biosíntesis de EPS. El mutante rkpK mostró un incremento en la auto-agregación y osmosensibilidad y una reducción de la formación del biofilm sobre superficies plásticas. La inactivación de rkpK afectó negativamente a la simbiosis con cowpea (una reducción de alrededor del 50% del número de nódulos fijadores de nitrógeno) pero no con soja. La mutación de lpsL condujo a una deficiencia completa con cowpea, mientras que las plantas de soja inoculadas con este mutante sólo formaron pseudonódulos. En ambas plantas, el mutante lpsL mostró defectos en la infección de sus raíces. Los resultados presentados en este capítulo están son un buen ejemplo de como en dos bacterias íntimamente relacionadas (como S. meliloti y S. fredii) el mismo gen puede estar involucrado en la producción de diferentes polisacáridos superficiales, así que la inactivación de ese gen puede tener un impacto diferente en la capacidad simbiótica de estas bacterias con sus plantas hospedadoras. Además, nuestros resultados están en consonancia con trabajos anteriores de nuestro grupo demostrando la alta relevancia del LPS de HH103 en simbiosis con diferentes plantas hospedadoras. Objetivo 2. Los resultados presentados en el correspondiente capítulo han sido publicados en Molecular Plant-Microbe Interactions (Acosta-Jurado et al., 2016a. Mol Plant Microbe Interact. 29:925-937). En trabajos anteriores de nuestro grupo de investigación se ha demostrado que S. fredii HH103 induce nódulos fijadores de nitrógeno en Lotus burttii pero nódulos inefectivos en L. japonicus Gifu (Sandal et al., 2012). En nuestro laboratorio tenemos disponible una colección de mutantes de HH103 afectados en la producción de diferentes polisacáridos superficiales. En esta tesis, hemos usado esta colección para investigar el posible papel (positivo o negativo) de cada uno de los polisacáridos superficiales de HH103 en su interacción con L. burttii y L. japonicus Gifu. Además, los estudios de microscopia confocal demostraron que S. fredii HH103 penetra en las raíces de L. burttii a través de roturas epidérmicas (de manera dependiente de factores Nod), a diferencia de Mesorhizobium loti MAFF303099 que infecta esta planta mediante tubos de infección (Maekawa et al., 2009). En cuanto a la interacción con L burttii, los mutantes de S. fredii HH103 incapaces de producir KPS y/o EPS no mostraron ningún tipo de defecto simbiótico, a diferencia de aquellos que tienen un perfil de LPS alterado, los cuales estuvieron afectados negativamente (se dieron reducciones severas del número de nódulos fijadores de nitrógeno). El mutante de S. fredii HH103 del gen cgs, incapaz de producir GC, mostró el mismo fenotipo simbiótico que con otras plantas hospedadoras (Crespo-Rivas et al., 2009); totalmente deficiente. Por otro lado, ninguno de los mutantes de S. fredii HH103 en polisacáridos superficiales ganó una nodulación efectiva con L. japonicus Gifu, sugiriendo que ninguno de estos polisacáridos es el responsable de la incompatibilidad simbiótica de S. fredii HH103 con esta planta. Objetivo 3. Los resultados presentados en el correspondiente capítulo han sido publicados en PLOS ONE (Acosta-Jurado et al., 2016b. PLOS ONE. 11:e0160499). A pesar del hecho que el EPS no muestra un papel importante en la simbiosis de S. fredii HH103 con diferentes leguminosas hospedadoras como soja, cowpea, Glycyrrhiza uralensis y Lotus burttii (Parada et al., 2006; Hidalgo et al., 2010; Margaret-Oliver et al., 2012; Acosta-Jurado et al., 2016a), la producción de este polisacárido está altamente regulado. Anteriores trabajos de nuestro grupo demostraron que la presencia de genisteína, un flavonoide inductor de los genes nod (Vinardell et al., 2004a), provocó una disminución de la mucosidad de HH103 en placas de YMA (Vinardell et al., 2004b). En esta tesis se demuestra que esta disminución de la mucosidad se debe a una reducción de la producción de exopolisacárido (confirmado por cuantificación de equivalentes de glucosa y análisis de H-RMN), y que este fenómeno no se da en otras estirpes de S. fredii como USDA257 o NGR234. Esta regulación negativa de la producción de EPS depende tanto de la capacidad del flavonoide para inducir la expresión de los genes nod como de la presencia de NodD1, indicando que, en S. fredii HH103, la biosíntesis de este polisacárido está conectada con el regulón nod. De hecho, en estudios anteriores hemos demostrado que NolR, un represor de los genes nod, tiene un efecto positivo sobre la producción de EPS en HH103. Teniendo en cuenta la importancia del EPS para los biofilm bacterianos, esta reducción de la producción de EPS por el tratamiento con flavonoides se correlaciona con la reducción de la capacidad formadora de biofilm. Mediante el uso de análisis de RT-PCR cuantitativa hemos demostrado que la expresión de los genes exoY1 y exoK se reprimió en cultivos de fase estacionaria de S. fredii HH103 en presencia de genisteína, siendo esta represión mayor en ausencia de NolR. Así, los resultados presentados en este trabajo demostraron que en la producción de EPS en S. fredii HH103 se regula de forma opuesta a otras señales bacterianas como los factores Nod y los efectores del sistema de secreción de tipo 3: Se reprime por flavonoides y NodD1 y se potencia por NolR. Estos resultados son acordes con nuestras observaciones anteriores en las que la ausencia de la producción de EPS en S. fredii HH103 no sólo no va en detrimento, sino que es beneficiosa para la simbiosis con soja. Además, nuestros resultados mostraron como bacterias íntimamente relacionadas pueden diferir en la regulación de sus polisacáridos superficiales: en S. fredii NGR234 la presencia de flavonoides disminuye la cantidad de KPS producido y promueve la biosíntesis de un tipo nuevo de LPS mientras que en HH103 afecta negativamente a la producción de EPS. Objetivo 4. Los resultados presentados en el correspondiente capítulo han sido publicados en Molecular Plant-Microbe Interactions (Acosta-Jurado et al., 2016c. Mol Plant Microbe Interact. 29:700-712). En los rizobios, el control de la producción de EPS es muy complejo y conlleva la participación de numerosas proteínas reguladoras, segundos mensajeros como di-GMP-c y sistemas de quorum sensing. Dentro de los reguladores, la proteína de tipo zinc finger MucR potencia la producción de EPS en los rizobios, como Sinorhizobium meliloti y Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, y participa en diversos procesos en otras bacterias como Caulobacter, Pseudomonas o Brucella (Janczarek, 2011; Mirabella et al., 2013; Caswell et al., 2013; Wang et al., 2015). MucR regula la expresión génica mediante su unión a secuencias palindrómicas llamadas mucR boxes. Estudios recientes han demostrado que esta proteína puede considerarse como un regulador global ya que está involucrado en el control de la expresión de genes de movilidad, quimiotaxis, virulencia e incluso NF, dependiendo de la bacteria. La secuenciación reciente del genoma de S. fredii HH103 ha revelado la presencia de dos copias de mucR en esta estirpe, mucR1 y mucR2. En esta tesis, hemos estudiado estos genes, centrándonos en su relevancia en la producción de EPS y en la simbiosis con soja y L. burttii. Como ha sido recientemente descrito en mucR2 de CCBAU45436 (Jiao et al., 2016), probablemente MucR2 de S. fredii HH103 no sea funcional debido a un cambio de pauta de lectura en su gen codificante. De hecho, el mutante mucR2 de S. fredii HH103 no mostró ninguna diferencia con la estirpe silvestre en ninguna de las características analizadas en este trabajo. Por el contrario, la inactivación de mucR1 provoca una reducción drástica de la producción de EPS, confirmado por aspecto de la mucosidad en placas de YMA, experimentos de H-NMR y cuantificación de los equivalentes de glucosa. Inesperadamente, el mutante ΔmucR1 mostró un incremento notable en su capacidad formadora de biofilm, probablemente debido al incremento de la agregación en la interfase aire-líquido. Además, la producción de GC extracelulares se incrementó en este mutante, probablemente como consecuencia de la reducción en la producción de EPS. Este mutante también mostró una reducción drástica de la capacidad fijadora de nitrógeno con G. max y L. burttii. Sin embargo, en estas dos leguminosas, el número de nódulos inducidos por el mutante mucR1 se incrementó y redujo respectivamente en comparación con la estirpe parental, indicando que MucR1 pueda afectar de forma diferente a la nodulación dependiendo de la planta hospedadora. Los análisis de RNA-Seq llevados a cabo en presencia y ausencia de flavonoides demostraron que MucR1 controla la expresión de cientos de genes (incluyendo algunos relacionados con la movilidad, producción de EPS o transporte de GC), algunos de ellos relacionados con el regulón nod. Estos estudios confirmaron trabajos anteriores indicando que en los rizobios MucR es un regulador global que controla numerosos procesos que pueden ser importantes en la transición de vida libre al estado simbiótico.Rhizobia are soil α- and β-proteobacteria able to stablish a nitrogen-fixing symbiosis with legume plants (Spaink et al., 1998; Suzaki et al., 2015). In this relationship, rhizobia induce the formation of new organs called nodules where they differentiated to bacteroids, the bacterial form able to fix nitrogen. The symbiotic process requires a complex molecular dialogue between plant and bacteria resulting in root infection the invasion of the nodules formed by the plant. There are different bacterial genera than can be included in the rhizobia group, being the most studied Rhizobium, Sinorhizobium (currently Ensifer; Willems, 2006), Bradyrhizobium and Mesorhizobium, all of them belonging to α-Proteobacteria. Among the legumes nodulated by rhizobia, there are several highly important crop plants like soybean, bean and cowpea. Soybean (Glycine max) is the most important worldwide agronomic legume since it can be used for multiple targets, such as for human and animal feeding, to get vegetal oil from its seeds and nutraceutical molecules like isoflavones, saponines or phytosterols, which are beneficial to human health. Soybean can be successful nodulated by strains belonging to different species of the Sinorhizobium, Mesorhizobium and Bradyrhizobium genera (Margaret et al., 2011; Rodríguez-Navarro et al., 2011), which can be differentiated according to their growth rate (from fast growing bacteria to slow growing bacteria, respectively). S. fredii is a species discovered in China, in 1985, and was the first fast growing bacteria that includes strains able to nodulate soybean. S. fredii strains are able to nodulate a very high number of host legumes but show differences in their ability to nodulate different soybean varieties. In fact, the three strains more studied so far differ in this ability: S. fredii NGR234 is not able to nodulate soybean, S. fredii USDA257 nodulates Asiatic soybeans but it is ineffective with American varieties, and S. fredii HH103 is able to nodulate both, American and Asiatic, soybean cultivars. The symbiosis requires a coordinated signal exchange between plants and rhizobia, and only when both symbionts are compatible, the nodulation process takes place (Downie, 2007; López-Baena et al., 2016).This process starts with the secretion by legume roots of a group of phenolic compounds called flavonoids that interact with a bacterial LysR transcriptional regulator, NodD. Only compatible flavonoids will activate the bacterial NodD protein. Therefore, this step stablishes a symbiotic specificity barrier to select compatible symbionts. In turn, NodD activates bacterial nodulation gene expression by binding to specific and conserved DNA sequence, named nod boxes (NB), located upstream of these genes. One of the groups of genes activated by NodD are those one (nod genes) responsible for Nod factors (NF) synthesis. NF are lipochitooligosaccharide molecules composed of 2 to 6 residues of N-Acetyl-Glucosamine residues linked by β-1,4 glycosidic bonds. The N-Acetyl-glucosamine residue locate on the non-reducing end is acylated with a fatty acid. NF can be decorated of different manners with different substitutions (fucosyl, methyl, sulphate and acetyl groups

Deciphering the Symbiotic Significance of Quorum Sensing Systems of Sinorhizobium fredii HH103

Quorum sensing (QS) is a bacterial cell-to-cell signaling mechanism that collectively regulates and synchronizes behaviors by means of small diffusible chemical molecules. In rhizobia, QS systems usually relies on the synthesis and detection of N-acyl-homoserine lactones (AHLs). In the model bacterium Sinorhizobium meliloti functions regulated by the QS systems TraI-TraR and SinI-SinR(-ExpR) include plasmid transfer, production of surface polysaccharides, motility, growth rate and nodulation. These systems are also present in other bacteria of the Sinorhizobium genus, with variations at the species and strain level. In Sinorhizobium fredii NGR234 phenotypes regulated by QS are plasmid transfer, growth rate, sedimentation, motility, biofilm formation, EPS production and copy number of the symbiotic plasmid (pSym). The analysis of the S. fredii HH103 genomes reveal also the presence of both QS systems. In this manuscript we characterized the QS systems of S. fredii HH103, determining that both TraI and SinI AHL-synthases proteins are responsible of the production of short- and long-chain AHLs, respectively, at very low and not physiological concentrations. Interestingly, the main HH103 luxR-type genes, expR and traR, are split into two ORFs, suggesting that in S. fredii HH103 the corresponding carboxy-terminal proteins, which contain the DNA-binding motives, may control target genes in an AHL-independent manner. The presence of a split traR gene is common in other S. fredii strains.Spanish Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) BIO2016-78409-

Supplementary material from: Genetic characterization of the ibuprofen degradative pathway of Rhizorhabdus wittichii MPO218

Supplementary materialIbuprofen is one of the most common drugs found as contaminants in soils, sediments and waters. Although several microorganisms able to metabolize ibuprofen have been described, the metabolic pathways and factors limiting biodegradation in nature remain poorly characterized. Among the bacteria able to grow on ibuprofen, three different strains belonging to Sphingomonadaceae and isolated from different geographical locations, carry the same set of genes required for the upper part of the ibuprofen metabolic pathway. Here, we have studied the metabolic pathway of Rhizorhabdus wittichii MPO218, identifying new genes required for the lower part of the ibuprofen metabolic pathway. We have identified two new DNA regions in MPO218 involved in the metabolism of ibuprofen. One is located on the MPO218 chromosome and appears to be required for the metabolism of propionyl-CoA through the methylmalonyl-CoA pathway. Although involved in ibuprofen metabolism, this region is not strictly necessary for growing using ibuprofen. The second region belongs to the pIBU218 plasmid and comprises two gene clusters containing aromatic compounds biodegradation genes, part of which are necessary to ibuprofen degradation. We have identified two genes required for the first two steps of the lower part of the ibuprofen metabolic pathway (ipfL and ipfM) and, based on our results, we propose the putative complete pathway for ibuprofen metabolism in strain MPO218.Centro Andaluz de Biología del Desarroll

Sinorhizobium fredii HH103 RirA is required for oxidative stress resistance and efficient symbiosis with Soybean

Members of Rhizobiaceae contain a homologue of the iron-responsive regulatory protein RirA. In different bacteria, RirA acts as a repressor of iron uptake systems under iron-replete conditions and contributes to ameliorate cell damage during oxidative stress. In Rhizobium leguminosarum and Sinorhizobium meliloti, mutations in rirA do not impair symbiotic nitrogen fixation. In this study, a rirA mutant of broad host range S. fredii HH103 has been constructed (SVQ780) and its free-living and symbiotic phenotypes evaluated. No production of siderophores could be detected in either the wild-type or SVQ780. The rirA mutant exhibited a growth advantage under iron-deficient conditions and hypersensitivity to hydrogen peroxide in iron-rich medium. Transcription of rirA in HH103 is subject to autoregulation and inactivation of the gene upregulates fbpA, a gene putatively involved in iron transport. The S. fredii rirA mutant was able to nodulate soybean plants, but symbiotic nitrogen fixation was impaired. Nodules induced by the mutant were poorly infected compared to those induced by the wild-type. Genetic complementation reversed the mutant’s hypersensitivity to H2O2, expression of fbpA, and symbiotic deficiency in soybean plants. This is the first report that demonstrates a role for RirA in the Rhizobium-legume symbiosis.Andalucian Government Grant No. P11-CVI-7500Spanish Government Grant Nos. BIO2013-42801-P and BIO2016-78409-REuropean Regional Development Funds (ERDF)VPPI (V Plan Propio de Investigación) of University of Seville

The Sinorhizobium fredii HH103 double-edged sword

Rhizobia are soil proteobacteria able to stablish an efficient symbiosis with legume plants (Poole et al., 2018). In this interaction, bacteria infect the plant roots and penetrate inside through the root hairs. Simultaneously to the infection process, plant develop new organs called nodules, generally located on roots, which hosted the rhizobial cells. Once rhizobia are located in the nodules, they invade the plant cells and differentiate into bacteroids, a morphological and physiological state able to fix the atmospheric nitrogen to ammonium, which is supplied to the plant (Tsyganova et al., 2017). This interaction requires a complex and coordinated molecular signals interchange between two partners, since this event determine the susceptible plants to be nodulate by a specific rhizobium and therefore the success of the process (Oldroyd 2013). One of these signals are the molecules called Nod Factors, lipochitooligosaccharides secreted by the bacteria in response to the plant signals and detected by the plant receptors. Several bacterial regulators finely regulate these molecules; however, their overproduction produces changes in the host specificity and the effectiveness of the infection process.Motivation: Since the host specificity is determined by the bacterial and plant signals, the alteration of some of them could modify the bacterial host range and even increase the efficiency with other plants.Methods: All the experiments were carried out with Sinorhizobium fredii HH103, a rhizobial strain isolated from China and natural symbiont of soybean (Glycine max cv. Williams).Gene expression analysis were carried out by RNA-seq and validated by RT-qPCR.Nod Factors were extracted from the supernatant culture and analysed by HPLC-HRMS/MS.Plant assays with Glycine max cv. Williams, Lotus burttii and L. japonicus Gifu were carried out in Leonard jars.Infection mode analyses were carried out by epifluorescence microscopy.Results: The mutation of any regulator that finely regulates the Nod Factor production causes an increase of Nod Factor gene expression, among other changes in the gene expression pattern, and in consequence an overproduction of these molecules. These changes provoke a partial impairment in symbiosis with soybean, its natural host, but on the other hand improve the nodulation effectiveness with L. burttii and allow the gaining the nodulation capacity with L. japonicus Gifu, where the wild type strain is not able to stablish an effective symbiosis. The infection mode analysis revealed that these mutants switched the infection way from intercellular infection, a primitive mode, to infection threads formation, more evolved way.Conclusions: S. fredii HH103 has evolved with its natural host, soybean, to improve their symbiotic performance even though it could diminish or abolish the nodulation effectivity with other legume plants

Sinorhizobium fredii Strains HH103 and NGR234 Form Nitrogen Fixing Nodules With Diverse Wild Soybeans (Glycine soja) From Central China but Are Ineffective on Northern China Accessions

Sinorhizobium fredii indigenous populations are prevalent in provinces of Central China whereas Bradyrhizobium species (Bradyrhizobium japonicum, B. diazoefficiens, B. elkanii, and others) are more abundant in northern and southern provinces. The symbiotic properties of different soybean rhizobia have been investigated with 40 different wild soybean (Glycine soja) accessions from China, Japan, Russia, and South Korea. Bradyrhizobial strains nodulated all the wild soybeans tested, albeit efficiency of nitrogen fixation varied considerably among accessions. The symbiotic capacity of S. fredii HH103 with wild soybeans from Central China was clearly better than with the accessions found elsewhere. S. fredii NGR234, the rhizobial strain showing the broadest host range ever described, also formed nitrogen-fixing nodules with different G. soja accessions from Central China. To our knowledge, this is the first report describing an effective symbiosis between S. fredii NGR234 and G. soja. Mobilization of the S. fredii HH103 symbiotic plasmid to a NGR234 pSym-cured derivative (strain NGR234C) yielded transconjugants that formed ineffective nodules with G. max cv. Williams 82 and G. soja accession CH4. By contrast, transfer of the symbiotic plasmid pNGR234a to a pSym-cured derivative of S. fredii USDA193 generated transconjugants that effectively nodulated G. soja accession CH4 but failed to nodulate with G. max cv. Williams 82. These results indicate that intra-specific transference of the S. fredii symbiotic plasmids generates new strains with unpredictable symbiotic properties, probably due to the occurrence of new combinations of symbiotic signals.España, Junta de Andalucía P11-CVI-7500España Ministerio de Economía y Competitividad BIO2016-78409-

Transcriptomic studies of the effect of nod gene-inducing molecules in rhizobia: Different weapons, one purpose

Simultaneous quantification of transcripts of the whole bacterial genome allows the analysis of the global transcriptional response under changing conditions. RNA-seq and microarrays are the most used techniques to measure these transcriptomic changes, and both complement each other in transcriptome profiling. In this review, we exhaustively compiled the symbiosis-related transcriptomic reports (microarrays and RNA sequencing) carried out hitherto in rhizobia. This review is specially focused on transcriptomic changes that takes place when five rhizobial species, Bradyrhizobium japonicum (=diazoefficiens) USDA 110, Rhizobium leguminosarum biovar viciae 3841, Rhizobium tropici CIAT 899, Sinorhizobium (=Ensifer) meliloti 1021 and S. fredii HH103, recognize inducing flavonoids, plant-exuded phenolic compounds that activate the biosynthesis and export of Nod factors (NF) in all analysed rhizobia. Interestingly, our global transcriptomic comparison also indicates that each rhizobial species possesses its own arsenal of molecular weapons accompanying the set of NF in order to establish a successful interaction with host legumes.Ministerio de Economía y Competitividad BIO2016-78409-R, AGL2016-77163-

Characterization of the antimicrobial activity of a clone with metagenomic DNA from a refinery.

Motivation: The increase in the number of antibiotic resistance mechanisms in microorganisms added to the low rate of newantimicrobial (AM) development supposes a threat for public health that should be urgently approached. Bacteria are one ofthe biggest sources of AM but only a small fraction of them can be cultured in vitro. To overcome this limitation our lab uses afunctional metagenomic approach and had previously developed a heterologous expression system that allows the study of allthe gene pool from a specific environmen1,2. Using this strategy we found different clones whose metagenomic DNA expresssion produces AM activity against Micrococcus luteus and also against the Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), one of the World Health Organization’s main priorities regarding resistant bacteria. In this work we study the properties and the activity of the AM produced by three different subclones with homologous genes related to phenol metabolism that were found in two different metagenomic libraries and we further characterize one of these subclones, pMPO1718, which proceeds from a refinery metagenomic library.Methods: The AM is produced in liquid cultures, the antimicrobial production is increased with arabinose for 6-7h and thenthe supernatant is filtered and lyophilized. The AM activity is tested on LB soft agar plates inoculated with the target strains.The AM is separated in different fractions by chromatography to study in which of them the activity is present.Results: We have defined a protocol to produce the AM in minimum media complemented with tryptophan and we haveobserved AM activity against M.luteus in the filtered culture and even higher activity in the total culture extracted with acetone50%. The last one was analyzed by high performance liquid chromatography and mass spectrometry by Fundación MEDINAand the comparison with databases showed that it may be an AM not previously described. Some AM properties arecharacterized in this work such as the minimum inhibitory concentration, the minimum bactericidal concentration, itsthermostability, its activity in different solvents or against different bacteria.Conclusions: The filtered supernatant of the three different subclones has AM activity against M.luteus and MRSA producedby phenol hydroxylase related genes. This AM is thermostable until more than 100ºC, has bactericidal activity and can beproduced either in LB medium or in M9 medium complemented with tryptophan

A transcriptomic analysis of the effect of genistein on Sinorhizobium fredii HH103 reveals novel rhizobial genes putatively involved in symbiosis

Sinorhizobium fredii HH103 is a rhizobial soybean symbiont that exhibits an extremely broad host-range. Flavonoids exuded by legume roots induce the expression of rhizobial symbiotic genes and activate the bacterial protein NodD, which binds to regulatory DNA sequences called nod boxes (NB). NB drive the expression of genes involved in the production of molecular signals (Nod factors) as well as the transcription of ttsI, whose encoded product binds to tts boxes (TB), inducing the secretion of proteins (effectors) through the type 3 secretion system (T3SS). In this work, a S. fredii HH103 global gene expression analysis in the presence of the flavonoid genistein was carried out, revealing a complex regulatory network. Three groups of genes differentially expressed were identified: i) genes controlled by NB, ii) genes regulated by TB, and iii) genes not preceded by a NB or a TB. Interestingly, we have found differentially expressed genes not previously studied in rhizobia, being some of them not related to Nod factors or the T3SS. Future characterization of these putative symbiotic-related genes could shed light on the understanding of the complex molecular dialogue established between rhizobia and legumes.España, Ministerio de Economía y Competitividad BIO2011-30229-C01España, Ministerio de Economía y Competitividad AGL2012-38831Junta de Andalucía, P11-CVI-7050Junta de Andalucía P11-CVI-750

Exopolysaccharide Production by Sinorhizobium fredii HH103 Is Repressed by Genistein in a NodD1-Dependent Manner

In the rhizobia-legume symbiotic interaction, bacterial surface polysaccharides, such as exopolysaccharide (EPS), lipopolysaccharide (LPS), K-antigen polysaccharide (KPS) or cyclic glucans (CG), appear to play crucial roles either acting as signals required for the progression of the interaction and/or preventing host defence mechanisms. The symbiotic significance of each of these polysaccharides varies depending on the specific rhizobialegume couple. In this work we show that the production of exopolysaccharide by Sinorhizobium fredii HH103, but not by other S. fredii strains such as USDA257 or NGR234, is repressed by nod gene inducing flavonoids such as genistein and that this repression is dependent on the presence of a functional NodD1 protein. In agreement with the importance of EPS for bacterial biofilms, this reduced EPS production upon treatment with flavonoids correlates with decreased biofilm formation ability. By using quantitative RT-PCR analysis we show that expression of the exoY2 and exoK genes is repressed in late stationary cultures of S. fredii HH103 upon treatment with genistein. Results presented in this work show that in S. fredii HH103 EPS production is regulated just in the opposite way than other bacterial signals such as Nod factors and type 3 secreted effectors: it is repressed by flavonoids and NodD1 and enhanced by the nod repressor NolR. These results are in agreement with our previous observations showing that lack of EPS production by S. fredii HH103 is not only non-detrimental but even beneficial for symbiosis with soybeanMinisterio de Ciencia e Investigación BIO2011-30229-C02-01Junta de Andalucía P11-CVI-750