Specificul molecular genetic în Fenilcetonurie în Republica Moldova (anii 2018-2019)

Background. Phenylketonuria (PKU) is an autosomal recessive disorder, caused by phenylanine hydroxylase deficiency, leading to phenylalanine(Phe) accumulation in blood, that is responsible for progressive mental retardation. Objective of the study. The aim of the study was to diagnose PKU, on the basis of neonatal screening, organized in 2018-2019 and to review the cases by molecular methods and identify the mutations that caused the disease. Material and Method. In 2018-2019, 62943 of newborns were subjected to neonatal screening in Moldova (screening rate 96.16%), based on the fluorometric method. There were 17 children diagnosed with PKU, from which 11 were tested by PCR/RFLP on 6 frequent mutations in PAH gene (R408W, P281L, L48S, R158Q, R252W, R261Q) and sequencing of the exons 2,3,5,6-8,10-13 by Sanger method. Results. As a result of neonatal screening, there were identified 376 suspects for PKU, showing Phe blood levels >3 mg/dL, from which only 17 were confirmed with PKU. The DNA samples were collected from 11 PKU subjects. The molecular analysis by PCR/RFLP method lead to identification of 45.45% of mutations. The most frequent genotype was R408W/L48S, established in 3 patients. The replenishment of the study with Sanger sequencing results enabled detection of complete genotype by following: splicing (IVS7+4A>G, IVS11+7T>C, IVS12+1G>A), missense (A342T), and nonsense (R111X) mutations. Conclusion. To conclude, there was identified the spectrum of mutations specific to Moldovan PKU cohort diagnosed in 2018-2019, grace to efficient organization of neonatal screening and diagnostics of PKU. Introducere. Fenilcetonuria (PKU) este o patologie autosomal recesivă, cauzată de deficiența enzimei fenilalanin hidroxilaza, care duce la acumularea fenilalaninei (Phe) serice, cauzând retard mental. Scopul lucrării. Scopul studiului a fost de a diagnostica PKU în baza screeningului neonatal, organizat în perioada 2018-2019, precum și a cerceta la nivel molecular genetic pacienții identificați pentru stabilirea mutațiilor, cauzatoare de boală. Material și Metode. În perioada 2018-2019 au fost supuși screeningului 62943 de nou-născuți din Republica Moldova (rata de screening 96,16%), în baza metodei fluorometrice. La 17 copii a fost detectată PKU, iar 11 au fost testați genetic prin metoda PCR/RFLP la 6 mutații în gena PAH (R408W, P281L, L48S, R158Q, R252W, R261Q) și secvențierea exonilor 2,3,5,6-8,10-13 ai genei PAH după metoda Sanger. Rezultate. În urma screening-ului, s-au identificat 376 de suspecți la PKU, prezentând valori ale Phe>3 mg/dL, dintre care doar 17 au fost confirmați cu PKU, ADN- ul a fost obținut de la 11 pacienți. Analiza molecular-genetică prin PCR/RFLP a permis detectarea mutațiilor în 45,45% de cazuri. Cel mai frecvent genotip a fost R408W/L48S, stabilit la 3 pacienți. Suplinirea analizei prin metoda Sanger a permis detectarea genotipului complet în restul cazurilor, determinând mutații de tip splicing (IVS7+4A>G, IVS11+7T>C, IVS12+1G>A), missense (A342T) și nonsense (R111X). Concluzii. În urma studiului, a fost detectat un spectru de mutații specifice cohortei PKU din Republica Moldova, datorită metodelor eficiente de screening și de diagnostic

Прогнозирование фенотипа у детей с фенилкетонурией из Молдовы на основе генетического анализа

Institute of Mother and Child, Chisinau, Republic of MoldovaIntroducere: Fenilcetonuria (PKU) este o boală metabolică autozomal recesivă, cauzată de deficienţa enzimei fenilalaninhidroxilaza ca urmare a mutațiilor din gena PAH. Luând în considerare, că celulele nervoase sunt cele mai sensibile la efectele toxice ale nivelelor ridicate ale fenilalaninei serice, retardul mental este unul din cele mai proeminente manifestări ale bolii. Tipul mutaţiei din gena PAH influenţează activitatea metabolică restantă a enzimei fenilalaninhidroxilaza. Scopul: Estimarea fenotipului prezis în raport cu genotipul la pacienţii cu PKU din Republica Moldova, pe baza diferitor programe de predicţie. Material și metode: În prezentul studiu au fost folosite datele a 9 pacienţi cu PKU, diagnosticaţi prin screeningul neonatal (>3 mg/dL) în perioada 2018-2019, la care s-au analizat mutațiile în gena PAH. Pentru estimarea fenotipului acestor pacienţi a fost folosită metoda valorii arbitrare (AV). A doua metodă a constat în utilizarea instrumentului online BIOPKU (BIOPKU; http://www.biopku.org). Identificarea mutaţiilor frecvente s-a realizat prin metoda PCR/ RFLP (p.R408W, p. P281L, p.L48S, p.R252W, p.R158Q, p.R261Q), iar pentru detectarea mutaţiilor mai rare s-a efectuat secvenţierea unor exoni din gena PAH. Rezultate: Utilizând datele despre genotipurile patologice identifi cate la cei 9 pacienți cu PKU investigaţi, a fost estimat fenotipul lor. Metoda de predicţie AV a dat rezultate în care 66.7% din pacienţi aveau forma clasică a PKU, pe când în 33.3% de cazuri a fost detectat fenotipul cu PKU moderată, nefiind prezise fenotipuri cu hiperfenilalaninemie (HPA). Cea de-a doua metodă, ce implica utilizarea bazei de date BIOPKU, a fost folostă în cazul a 8 genotipuri din 9 din cauza lipsei informaţiei despre o combinaţie de alele. Genotipurile celor 8 pacienţi au fost estimate ca tipice PKU clasice. Nu au fost înregistrate cazuri de formă moderată a PKU sau hiperfenilalaninemie. Comparând datele de la instumentele de predicţie cu fenotipurile observate, s-a constatat că există o diferenţă la nivelul genotipului p.R408W/p.L48S, analizat mai profund din perspectiva heterogenităţii sale. Prin acestea concludem că în Republica Moldova prevalează formele clasice de PKU înregistrate în ultimii 2 ani. Concluzii: Metodele de predicţie a fenotipului precum AV sau BIOPKU au punctele lor forte. În cazul completării bazelor de date internaţionale cu cazuri proprii, va spori calitatea și varietatea programelor de predicţie.Введение: Фенилкетонурия (ФКУ) - аутосомно рецессивная наследственная болезнь обмена веществ, вызванная нарушением активности печёночного фермента фенилаланин-гидроксилазы. Учитывая тот факт, что нервные клетки самые уязвимые к токсичному эффекту повышенных уровней фенилаланина в крови, наиболее явное проявление данной болезни — это задержка умственного развития. Мутации, отвечающие за фенилкетонурию происходят в гене фенилаланингидроксилазы (PAH). Тип мутации влияет на активность фермента и соответственно на фенотип.Цель: Прогнозирование фенотипа у больных ФКУ из Молдовы на основе генотипирования с помощью прогнозирующих программ. Материалы и методы: В качестве материала были использованы данные 9 молдавских пациентов с ФКУ, диагностированных неонатальным скринингом (>3 мг/дл), в период 2018-2019, с полным выявленным генотипом гена PAH. Для предсказания фенотипа был использован метод произвольного значения (AV). Второй метод включает в себя работу с программой BIOPKU (BIOPKU; http://www.biopku.org). Идентификация общих мутаций (p. R408W, p. P281L, p. L48S, p. R252W, p. R158Q, p. R261Q) была осуществлена с помощью ПЦР/ ПДРФ, а также выявление других редких мутаций с помощью секвенирования кодирующей части гена PAH. Результаты: Используя данные о патологических генотипах, выявленных в период 2018- 2019 были предсказаны фенотипы 9 пациентов с ФКУ. Полученные результаты при использовании системы (AV) показали преобладание классической формы ФКУ в 66,7%, исключение было представлено cредними формами ФКУ (33,3%). При использовании BIOPKU, было проанализировано 8 из 9 генотипов пациентов с ФКУ. В данном случае, все генотипы были обозначены как классическая форма ФКУ. Учитывая тот факт, что расчетный фенотип генотипа p.R408W/p.L48S отличается от такового в наблюдаемых случаях, данная комбинация была изучена подробнее из перспективы неоднородности фенотипов среди разных случаев. Как следствие, можно утвердить что в Молдове зарегистрированы классические формы ФКУ за последние 2 года. Заключение: Системы предсказания фенототипа, такие как метод AV и BIOPKU, могут быть полезными в исследовательской деятельности, каждая система, в свою очередь, имеют свои преимущества, пополняя интернациональные базы генетических данных, при этом качество прогнозов фенотипов значительно улучшится

Молекулярно-генетическая специфика фенилкетонурии в Республике Молдова (2018- 2019)

Institute of Mother and Child, Chisinau, Republic of MoldovaIntroducere: Fenilcetonuria (PKU) este o patologie autosomal recesivă, cauzată de deficienţa enzimei fenilalanin hidroxilaza, care duce la acumularea fenilalaninei (Phe) serice, cauzând retard mental. Scopul lucrării: Diagnosticarea PKU în baza screeningului neonatal, organizat în perioada 2018-2019, precum şi cercetarea, la nivel molecular genetic, a pacienţilor identificaţi pentru a stabili mutaţiile cauzatoare de boală. Material şi metode: În perioada 2018-2019 au fost supuşi screeningului 62943 de nou-născuţi din Moldova (rata de screening 96,16%), în baza metodei fluorometrice. La 17 copii a fost detectată PKU, iar 11 au fost testaţi genetic prin metoda PCR/RFLP la 6 mutaţii în gena PAH (p.R408W, p.P281L, p.L48S, .p.R158Q, p.R252W, p.R261Q) şi secvenţierea exonilor 2,3,5,6-8,10-13 ai genei PAH după metoda Sanger. Rezultate: Analiza molecular-genetică prin PCR/RFLP a permis detectarea mutaţiilor în 45,45% de cazuri. Cel mai frecvent genotip a fost p.R408W/p.L48S, stabilit la 3 pacienţi. Analiza suplimentară prin metoda Sanger a permis detectarea genotipului complet în restul cazurilor, determinând mutaţii de tip splicing (IVS7+4A>G, IVS11+7T>C, IVS12+1G>A), missense (p.A342T) şi nonsense (p.R111*). Concluzii: În urma studiului a fost detectat un spectru de mutaţii specifice cohortei PKU din Moldova, datorită metodelor eficiente de screening şi diagnostic.Введение: Фенилкетонурия (ФКУ) – это генетическое заболевание с аутосомно рецессивной моделью наследования обусловленное дефицитом фенилаланин- гидроксилазы. Дисфункция данного энзима приводит к накоплению фенилаланина в крови и последующим дегенеративным процессам в нервной системе. Цель: Целью исследования была диагностика пациентов с ФКУ с помощью неонатального скрининга, в период 2018-2019 годов, а так же проведение молекулярно- генетического изучения пациентов для идентификации мутаций в гене PAH. Материалы и методы: В период 2018-2019 годов, неонатальному скринингу подверглись 62943 новорождённых (доля 96,16%), по средством флуорометрического метода. У 17 детей была выявлена ФКУ, 11 из которых были подвержены ПЦР/ПДРФ анализу с целью выявления 6 частых мутаций в гене PAH (p.R408W, p.P281L, p.L48S, p.R158Q, p.R252W, p.R261Q) и секвенированию экзонов 2,3,5,6-8,10-13 гена PAH при помощи капилярного электрофореза по методике Sanger. Результаты: В результате проведения скрининга, были выявлены 376 подозреваемых случаев ФКУ, у которых показатели фенилаланина были больше 3 мг/дЛ, Образцы ДНК были получены у 11 из 17 подтвержденных пациентов. Молекулярно- генетическое исследование при помощи ПЦР/ПДРФ, позволило выявить мутации в 45,45% случаев. Самым распространённым генотипом оказался p.R408W/ p.L48S, выявленный у 3 пациентов. Пополнение исследования результатами секвенирования кодирующей части гена PAH позволило определить полный генотип в остальных случаях

Классическая галактоземия - описание клинического случая

Institute of Mother and Child, Chisinau, Republic of Moldova, Cytogenomic Medical Laboratory, Bucharest, Romania, “Petru Poni” Institute of Macromolecular Chemistry of Romanian Academy, Iasi, Romania, “C. D. Nenitescu” Centre of Organic Chemistry of Romanian Academy, Bucharest, RomaniaBackground: Galactosemia is an autosomal recessive metabolic error which is caused by deficiency in four enzymes coded by GALT, GALK, GALE, and GALM genes. Accumulation of galactose and its metabolites causes nervous system injuries, cataracts, kidney and liver damage, etc. The form of galactosemia characterized by the most severe manifestations is classic galactosemia associated with mutations in GALT gene. The current report is based on a case of a 9 month old patient manifesting hepatosplenomegaly, failure to thrive and incipient cataract, suggesting galactosemia, inducing the process of diagnosis. The aim: Presentation of a galactosemia case and association of the biochemical parameters with the molecular genetics results in order to find a correlation between the genotype and the phenotype. Material and methods: Quantification of the total blood galactose was performed on dry blood spots at CytoGenomic laboratory in Bucharest, Romania. Urine galactose and galactitol levels were determined using NMR spectroscopy of body fluids at the “Petru Poni” Institute of Macromolecular Chemistry Iași, Romania. The DNA was obtained from patient’s whole blood samples using salt- out method. The identification of p.Q188R mutation in GALT gene was done using PCR/RFLP technique with visualization in polyacrylamide and agarose gel. The second mutation, p.K285N, was established using Sanger Sequencing of all GALT gene exons. Results: The DBS analysis revealed an elevated level of total galactose- 40.34 mg/dL. The further step was NMR Spectroscopy of body fluids revealed high levels of urine galactose- 10255 mmol/mol creatinine on the first day of diagnosis and 25287 mmol/mol creatinine on the second day. The galactitol value on the first day was 9244 mmol/mol creatinine, on the second day- 8777 mmol/mol creatinine, and on the day 62 after the beginning of the treatment- 714 mmol/mol creatinine. The molecular genetics analysis revealed that the patient’s GALT gene genotype is p.Q188R/p. K285N, presenting a classical form of galactosemia. Conclusion: Galactosemia is a serious inborn error of galactose metabolism that needs fast and efficient biochemical diagnosis through neonatal screening and molecular genetics study for an effective treatment for prevention of the multisystem complications that the disease may cause.Introducere: Galactozemia este o eroare metabolică autozom-recesivă, care este cauzată de deficiența a patru enzime codate de genele GALT, GALK, GALE și GALM. Acumularea galactozei și a metaboliților săi provoacă afecțiuni ale sistemului nervos, cataractă, leziuni ale rinichilor și ficatului, etc. Forma de galactozemie caracterizată prin cele mai severe manifestări este galactozemia clasică asociată cu mutațiile din gena GALT. Raportul actual se bazează pe un caz al unui pacient de 9 luni, cu hepatosplenomegalie, dificultăți de dezvoltare și manifestări incipiente de cataractă, care au sugerat galactozemia, inducând procesul de diagnostic.Scopul: Prezentarea unui caz de galactozemie și asocierea parametrilor biochimici cu rezultatele geneticii moleculare pentru a elucida o corelație între genotip și fenotip. Materiale şi metode: Cuantificarea galactozei totale din sânge a fost efectuată din DBS la laboratorul CytoGenomic din București, România. Nivelurile de galactoză și galactitol în urină au fost determinate utilizând spectroscopia RMN a fluidelor corporale la Institutul de Chimie Macromoleculară „Petru Poni” Iași, România. ADN-ul a fost obținut din probele de sânge ale pacientului, folosind metoda salt- out. Identificarea mutației p.Q188R în gena GALT s-a realizat folosind tehnica PCR / RFLP cu vizualizare în poliacrilamidă și gel de agaroză. A doua mutație, p.K285N, a fost stabilită utilizând secvențierea Sanger a tuturor exonilor genei GALT. Rezultate: Analiza DBS a relevat un nivel crescut de galactoză totală - 40,34 mg/dL. Pasul următor a fost spectroscopia RMN a fluidelor corporale a relevat niveluri ridicate galactoză în urină- 10255 mmol / mol creatinină în prima zi de diagnostic și 25287 mmol / mol creatinină în a doua zi. Valoarea galactitolului în prima zi a fost de 9244 mmol/ mol creatinină, în a doua zi - 8777 mmol/mol creatinină și în ziua 62 după începerea tratamentului- 714 mmol/mol creatinină. Analiza molecular - genetică a demonstrat faptul că genotipul genei GALT a pacientului este p.Q188R / p.K285N, prezentând o formă clasică de galactozemie. Concluzii: Galactozemia este o eroare înnăscută gravă a metabolismului galactozei care necesită un diagnostic biochimic rapid și eficient prin screening neonatal și studiu molecular- genetic pentru stabilirea unui tratament eficient și prevenirea complicațiilor multisistemice pe care boala le poate provoca