Estragole: DNA adduct formation in primary rat hepatocytes and genotoxic potential in HepG2-CYP1A2 cells

Estragole is a natural constituent in herbs and spices and in products thereof such as essential oils or herbal teas. After cytochrome P450-catalyzed hydroxylation and subsequent sulfation, estragole acts as a genotoxic hepatocarcinogen forming DNA adducts in rodent liver. Because of the genotoxic mode of action and the widespread occurrence in food and phytomedicines a refined risk assessment for estragole is needed. We analyzed the time- and concentration-dependent levels of the DNA adducts N2-(isoestragole-3‘-yl)-2‘-desoxyguanosine (E3′N2dG) and N6-(isoestragole-3‘-yl)-desoxyadenosine (E3′N6dA), reported to be the major adducts formed in rat liver, in rat hepatocytes (pRH) in primary culture after incubation with estragole. DNA adduct levels were measured via UHPLC-ESI-MS/MS using stable isotope dilution analysis. Both adducts were formed in pRH and could already be quantified after an incubation time of 1 h (E3′N6dA at 10 μM, E3′N2dG at 1μM estragole). E3′N2dG, the main adduct at all incubation times and concentrations, could be detected at estragole concentrations < 0.1 μM after 24 h and < 0.5 μM after 48 h. Adduct levels were highest after 6 h and showed a downward trend at later time-points, possibly due to DNA repair and/or apoptosis. While the concentration-response characteristics of adduct formation were apparently linear over the whole concentration range, strong indication for marked hypo-linearity was obtained when the modeling was based on concentrations < 1 μM only. In the micronucleus assay no mutagenic potential of estragole was found in HepG2 cells whereas in HepG2-CYP1A2 cells 1 μM estragole led to a 3.2 fold and 300 μM to a 7.1 fold increase in micronuclei counts. Our findings suggest the existence of a ‘practical threshold’ dose for DNA adduct formation as an initiating key event of the carcinogenicity of estragole indicating that the default assumption of concentration-response-linearity is questionable, at least for the two major adducts studied here

Estragol: Bestimmung von DNA-Addukten in primären Rattenhepatozyten und genotoxisches Potential

Estragole is a secondary plant metabolite, belonging to the group of phenylpropanoids and is a natural constituent in the essential oil of herbs and spices like tarragon, anise or fennel. Due to its natural occurrence in food, estragole is part of the human nutrition. In vivo estragole acts as a carcinogen and leads to the development of hepatocellular carcinomas in the liver of rodents. The Ames mutation assay in Salmonella typhimurium strain TA100 shows a genotoxic potency for estragole, while the results in other bacteria strains are negative. Different in-vitro-studies confirm the genotoxic potency in eukaryotic cells. Because of the genotoxic mode of action and the natural occurrence in food a refine risk assessment for estragole is needed. The metabolic activation of estragole is attributed to cytochrome-P450-catalyzed hydroxylation to 1'-hydroxyestragole followed by sulfonation to 1'-sulfoxyestragole via sulfotransferases. A spontaneous release of the sulfate group can lead to the formation of a reactive carbeniumion, which can act as a genotoxic carcinogen and can bind to the DNA. Different in-vivo and in-vitro-studies showed the DNA-adduct formation after treatment with estragole or the reactive metabolite 1'-hydroxyestragole. Using 32P-postlabeling, three deoxyguanosine-adducts and one deoxyadenosine-adduct were identified. In different studies N2-(isoestragole-3'-yl)-2'-deoxyguanosin and N6-(isoestragole-3'-yl)-6'-deoxyadenosin was found to be the main adducts in primary rat hepatocytes. The aim of this thesis was developing a sensitive method for the quantification of the adducts N2-(isoestragole-3'-yl)-2'-deoxyguanosin and N6-(isoestragole-3'-yl)-6'-deoxyadenosin, using an UHPLC-ESI-MS/MS-method and a stable isotope dilution analysis. With this method the DNA-adducts could be detected and quantified in primary rat hepatocytes after incubation with estragole. It was shown that the DNA-adduct formation is time and concentration depended. The highest adduct level was observed after an incubation time of 6 h with a downwards trend for the incubation time of 24 h and 48 h. As the main adduct of estragole N2-(isoestragole-3'-yl)-2'-deoxyguanosin was detected. Over the whole concentration range a linear concentration-response was observed at all incubation times (1 h, 6 h, 24 h, 48 h). In a concentration range of 0.01–1 µM estragole an indication for a non-linear concentration-response with a possible threshold was observed. Both adducts were quantified after an incubation time of 1 h (at concentrations of N2-(isoestragole-3'-yl)-2'-deoxyguanosin higher than 1 µM and N6-(isoestragole-3'-yl)-6'-deoxyadenosin higher than 10 µM), with N2-(isoestragole-3'-yl)-2'-deoxyguanosin being detectable at all incubation times and concentrations. In the micronucleus assay no genotoxic potency of estragole in HepG2-cells was found. In HepG2-CYP1A2-cells, which overexpress the enzyme CYP1A2, on the other hand all tested concentrations lead to a significant increase in micronuclei counts. The increase of the micronuclei counts was concentration-dependent, with a 3.2-fold increase at 1 µM estragole and 7.1-fold increase at 300 µM estragole in comparison to the solvent control.Estragol gehört zur Gruppe der Phenylpropanoide, bei denen es sich um sekundäre Pflanzenmetaboliten handelt. Estragol ist vor allem im etherischen Öl von Kräutern und Gewürzen zu finden und ist somit Bestandteil der menschlichen Ernährung. In Tierstudien konnte gezeigt werden, dass Estragol ein natürlich vorkommendes Kanzerogen ist und bei Nagern zu hepatozellulären Karzinomen führt. Im Ames-Mutationstest sind Estragol bzw. Phase-I-Metaboliten in den meisten Fällen nicht mutagen, wobei im Stamm TA100 ein mutagenes Potential gezeigt werden konnten. Verschiedene in-vitro-Studien in Säugerzellen geben ebenfalls Hinweise auf ein mutagenes Potential von Estragol. Wegen des genotoxischen Wirkmechanismus und dem natürlichen Vorkommen von Estragol in Lebensmitteln ist eine Risikobewertung für Estragol sinnvoll. Durch 1'-Hydroxylierung über Cytochrom-P450-Enzyme und anschließender Sulfonierung über Sulfotransferasen wird Estragol metabolisch aktiviert. Nach spontaner Abspaltung der Sulfatgruppe entsteht ein ultimales Kanzerogen, welches an die DNA binden kann. Verschiedene in-vivo- und in-vitro-Studien zeigten die Bildung von DNA-Addukten nach Behandlung mit Estragol bzw. 1'-Hydroxyestragol. Dabei konnten mittels 32P-Postlabeling drei dG-Addukte und ein dA-Addukt identifiziert werden. In der Literatur wurden N2-(Isoestragol-3'-yl)-2'-desoxyguanosin und N6-(Isoestragol-3'-yl)-6'-desoxyadenosin als Hauptaddukte in primären Rattenhepatozyten (pRH) identifiziert. In verschiedenen Studien wurde in Zelllinien und in der Leber von Versuchstieren vor allem das N2-(Isoestragol-3'-yl)-2'-desoxyguanosin quantifiziert. In dieser Arbeit konnte eine sensitive Quantifizierungsmethode für die beiden DNA-Addukte N2-(Isoestragol-3'-yl)-2'-desoxyguanosin und N6-(Isoestragol-3'-yl)-6'-desoxyadenosin mittels UHPLC-ESI-MS/MS und Stabilisotopen-Verdünnungsanalyse entwickelt werden. Mit Hilfe dieser Methode konnten beide Addukte in pRH nach Inkubation mit Estragol quantifiziert werden. Dabei konnte in dieser Arbeit eine konzentrations- und zeitabhängige Bildung beider Addukte gezeigt werden. Zu allen Inkubationszeitpunkten (1 h, 6 h, 24 h und 48 h) wurde über den gesamten Konzentrationsbereich (0,01–300 µM) Estragol eine lineare Konzentrations-Wirkungsbeziehung gezeigt, während für den Konzentrationsbereich von 0,01–1 µM Estragol eine nicht lineare Konzentrations-Wirkungsbeziehung gezeigt werden konnte. Dabei handelte es sich bei N2-(Isoestragol-3'-yl)-2'-desoxyguanosin um das Hauptaddukt. Beide Addukte konnten bereits ab einer Inkubationszeit von 1 h (N2-(Isoestragol-3'-yl)-2'-desoxyguanosin ab 1 µM und N6-(Isoestragol-3'-yl)-6'-desoxyadenosin ab 10 µM) quantifiziert werden. Die Untersuchung der Genotoxizität mittels Mikrokerntest zeigte in HepG2-Zellen kein genotoxisches Potential im Konzentrationsbereich von 1–300 µM Estragol. In HepG2-CYP1A2-Zellen, die CYP1A2 überexprimieren, zeigte sich ab einer Konzentration von 1 µM ein genotoxischer Effekt, wobei die Mikrokernrate über den kompletten Konzentrationsbereich konzentrationsabhängig ansteigt. Die Erhöhung der Mikrokernrate lag zwischen dem 3,2fachen bei einer Konzentration von 1 µM und dem 7,1fachen bei einer Konzentration von 300 µM im Vergleich zu Lösungsmittelkontrolle

Estragol: Bestimmung von DNA-Addukten in primären Rattenhepatozyten und genotoxisches Potential

Estragole is a secondary plant metabolite, belonging to the group of phenylpropanoids and is a natural constituent in the essential oil of herbs and spices like tarragon, anise or fennel. Due to its natural occurrence in food, estragole is part of the human nutrition. In vivo estragole acts as a carcinogen and leads to the development of hepatocellular carcinomas in the liver of rodents. The Ames mutation assay in Salmonella typhimurium strain TA100 shows a genotoxic potency for estragole, while the results in other bacteria strains are negative. Different in-vitro-studies confirm the genotoxic potency in eukaryotic cells. Because of the genotoxic mode of action and the natural occurrence in food a refine risk assessment for estragole is needed. The metabolic activation of estragole is attributed to cytochrome-P450-catalyzed hydroxylation to 1'-hydroxyestragole followed by sulfonation to 1'-sulfoxyestragole via sulfotransferases. A spontaneous release of the sulfate group can lead to the formation of a reactive carbeniumion, which can act as a genotoxic carcinogen and can bind to the DNA. Different in-vivo and in-vitro-studies showed the DNA-adduct formation after treatment with estragole or the reactive metabolite 1'-hydroxyestragole. Using 32P-postlabeling, three deoxyguanosine-adducts and one deoxyadenosine-adduct were identified. In different studies N2-(isoestragole-3'-yl)-2'-deoxyguanosin and N6-(isoestragole-3'-yl)-6'-deoxyadenosin was found to be the main adducts in primary rat hepatocytes. The aim of this thesis was developing a sensitive method for the quantification of the adducts N2-(isoestragole-3'-yl)-2'-deoxyguanosin and N6-(isoestragole-3'-yl)-6'-deoxyadenosin, using an UHPLC-ESI-MS/MS-method and a stable isotope dilution analysis. With this method the DNA-adducts could be detected and quantified in primary rat hepatocytes after incubation with estragole. It was shown that the DNA-adduct formation is time and concentration depended. The highest adduct level was observed after an incubation time of 6 h with a downwards trend for the incubation time of 24 h and 48 h. As the main adduct of estragole N2-(isoestragole-3'-yl)-2'-deoxyguanosin was detected. Over the whole concentration range a linear concentration-response was observed at all incubation times (1 h, 6 h, 24 h, 48 h). In a concentration range of 0.01–1 µM estragole an indication for a non-linear concentration-response with a possible threshold was observed. Both adducts were quantified after an incubation time of 1 h (at concentrations of N2-(isoestragole-3'-yl)-2'-deoxyguanosin higher than 1 µM and N6-(isoestragole-3'-yl)-6'-deoxyadenosin higher than 10 µM), with N2-(isoestragole-3'-yl)-2'-deoxyguanosin being detectable at all incubation times and concentrations. In the micronucleus assay no genotoxic potency of estragole in HepG2-cells was found. In HepG2-CYP1A2-cells, which overexpress the enzyme CYP1A2, on the other hand all tested concentrations lead to a significant increase in micronuclei counts. The increase of the micronuclei counts was concentration-dependent, with a 3.2-fold increase at 1 µM estragole and 7.1-fold increase at 300 µM estragole in comparison to the solvent control.Estragol gehört zur Gruppe der Phenylpropanoide, bei denen es sich um sekundäre Pflanzenmetaboliten handelt. Estragol ist vor allem im etherischen Öl von Kräutern und Gewürzen zu finden und ist somit Bestandteil der menschlichen Ernährung. In Tierstudien konnte gezeigt werden, dass Estragol ein natürlich vorkommendes Kanzerogen ist und bei Nagern zu hepatozellulären Karzinomen führt. Im Ames-Mutationstest sind Estragol bzw. Phase-I-Metaboliten in den meisten Fällen nicht mutagen, wobei im Stamm TA100 ein mutagenes Potential gezeigt werden konnten. Verschiedene in-vitro-Studien in Säugerzellen geben ebenfalls Hinweise auf ein mutagenes Potential von Estragol. Wegen des genotoxischen Wirkmechanismus und dem natürlichen Vorkommen von Estragol in Lebensmitteln ist eine Risikobewertung für Estragol sinnvoll. Durch 1'-Hydroxylierung über Cytochrom-P450-Enzyme und anschließender Sulfonierung über Sulfotransferasen wird Estragol metabolisch aktiviert. Nach spontaner Abspaltung der Sulfatgruppe entsteht ein ultimales Kanzerogen, welches an die DNA binden kann. Verschiedene in-vivo- und in-vitro-Studien zeigten die Bildung von DNA-Addukten nach Behandlung mit Estragol bzw. 1'-Hydroxyestragol. Dabei konnten mittels 32P-Postlabeling drei dG-Addukte und ein dA-Addukt identifiziert werden. In der Literatur wurden N2-(Isoestragol-3'-yl)-2'-desoxyguanosin und N6-(Isoestragol-3'-yl)-6'-desoxyadenosin als Hauptaddukte in primären Rattenhepatozyten (pRH) identifiziert. In verschiedenen Studien wurde in Zelllinien und in der Leber von Versuchstieren vor allem das N2-(Isoestragol-3'-yl)-2'-desoxyguanosin quantifiziert. In dieser Arbeit konnte eine sensitive Quantifizierungsmethode für die beiden DNA-Addukte N2-(Isoestragol-3'-yl)-2'-desoxyguanosin und N6-(Isoestragol-3'-yl)-6'-desoxyadenosin mittels UHPLC-ESI-MS/MS und Stabilisotopen-Verdünnungsanalyse entwickelt werden. Mit Hilfe dieser Methode konnten beide Addukte in pRH nach Inkubation mit Estragol quantifiziert werden. Dabei konnte in dieser Arbeit eine konzentrations- und zeitabhängige Bildung beider Addukte gezeigt werden. Zu allen Inkubationszeitpunkten (1 h, 6 h, 24 h und 48 h) wurde über den gesamten Konzentrationsbereich (0,01–300 µM) Estragol eine lineare Konzentrations-Wirkungsbeziehung gezeigt, während für den Konzentrationsbereich von 0,01–1 µM Estragol eine nicht lineare Konzentrations-Wirkungsbeziehung gezeigt werden konnte. Dabei handelte es sich bei N2-(Isoestragol-3'-yl)-2'-desoxyguanosin um das Hauptaddukt. Beide Addukte konnten bereits ab einer Inkubationszeit von 1 h (N2-(Isoestragol-3'-yl)-2'-desoxyguanosin ab 1 µM und N6-(Isoestragol-3'-yl)-6'-desoxyadenosin ab 10 µM) quantifiziert werden. Die Untersuchung der Genotoxizität mittels Mikrokerntest zeigte in HepG2-Zellen kein genotoxisches Potential im Konzentrationsbereich von 1–300 µM Estragol. In HepG2-CYP1A2-Zellen, die CYP1A2 überexprimieren, zeigte sich ab einer Konzentration von 1 µM ein genotoxischer Effekt, wobei die Mikrokernrate über den kompletten Konzentrationsbereich konzentrationsabhängig ansteigt. Die Erhöhung der Mikrokernrate lag zwischen dem 3,2fachen bei einer Konzentration von 1 µM und dem 7,1fachen bei einer Konzentration von 300 µM im Vergleich zu Lösungsmittelkontrolle