Identifizierung und Charakterisierung genetischer Ursachen von Wachstumsstörungen

Objectives Growth disorders are characterized as deviation of body height of an individual from age related standards. Growth retardation is specified by body height under the 3rd percentile or more than two standard deviations below the average of the genetic target range of a defined population. Therefore growth retardation and disorders present a common medical issue in pediatric and human genetic counselling. Although growth and body height are associated with a high heritability of 80 to 90 %, the underlying genetic cause of short stature cannot be detected in the majority of affected individuals. The objective of this thesis was the identification of causal mutations in individuals with idiopathic growth disorders by exome sequencing. Design and Methods Twelve non-consanguineous families with affected children were analyzed in order to identify rare variants as possibly underlying genetic cause. Therefore exome sequencing of all affected individuals and their parents was performed. All variants confirmed by Sanger sequencing were further categorized by computer-based prediction analysis and evaluation of the protein function of the associated gene. For the resulting candidate genes I performed reverse transcription polymerase chain reaction (rt-PCR) in order to determine alternative splicing and expression analysis in the patients by quantitative Real-Time PCR (qPCR). Thereafter a control group of 382 individuals was screened for the presence of the identified variants. For two candidate genes a patient cohort with idiopathic growth disorders was examined in order to identify further mutations. Observations and Results By performing exome sequencing and Sanger confirmation I was able to identify 30 variants in twelve families. After characterization of the variants by computer-based prediction analysis and protein function of the corresponding genes 14 potentially pathogenic variants in nine genes and eight families remained. In three individuals I was able to determine rare growth disorders associated with the affected genes (Kniest dysplasia, Mulibrey nanism, hypertension and brachydaktyly syndrome). In three further patients we identified variants in candidate genes. MCF2L encodes an oncogene, that is predominantly expressed in neuronal tissue and showed elevated expression levels in the patient. ARID4A is a gene involved in the regulation of cell proliferation. EIF3G gene was further pursued due to the results of the functional analyses and its role in translation initiation of proteins.Impairment of this function could lead to alteration of cell growth or signaling pathways. In order to determine the pathogenicity of the identified variants and associated genes more patients with variants in these genes need to be identified and further functional experiments have to be performed. Conclusions I was able to underline the importance of exome sequencing as an appropriate method to identify causative and possibly pathogenic variants in individuals with idiopathic growth disorders. Furthermore the identification of rare genetic growth disorders can have therapeutic consequences like surveillance or specific therapy. This could be demonstrated for Mulibrey nanism where affected individuals have an elevated risk for neoplasia and cardiac disease as well as for hypertension and brachydaktyly syndrome which is associated with severe hypertension.Hintergrund und Ziele Wachstumsstörungen werden durch das Abweichen des Höhenwachstums eines heranwachsenden Menschen von der Norm charakterisiert. Von einer Wachstumsverzögerung spricht man, wenn die Körperhöhe, bezogen auf die jeweilige Population, unterhalb der 3. Perzentile der Norm oder mehr als zwei Standardabweichungen unter dem Mittelwert des genetischen Zielbereichs einer Population liegt. Daher stellt Kleinwuchs eine häufige Fragestellung in der Pädiatrie und der humangenetischen Beratung dar. Obgleich Wachstum und Körperhöhe mit einer hohen Heretabilität von 80 bis 90 % einhergehen, kann die genetische Ursache des Kleinwuchses bei einem Großteil der Betroffenen bislang nicht aufgedeckt werden. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Identifizierung ursächlicher genetischer Veränderungen idiopathischer Wachstumsstörungen bei Patienten mittels Exomsequenzierung. Methoden (Patienten, Material und Untersuchungsmethoden) Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwölf nicht-konsanguine Familien mit betroffenen Kindern auf seltene Varianten als mögliche krankheitsverursachende Mutationen untersucht. Dazu wurde das Exom aller gesunden Elternpaare und Patienten mittels Next Generation Sequencing auf genetische Veränderungen durchsucht. Durch Sanger-Sequenzierung validierte Varianten wurden durch computergestütze Analysen und anhand ihrer Proteinfunktion bewertet. Für die vielversprechenden Kandidatengene wurden ein alternatives Splicen durch reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (rt-PCR) und die Expression der betroffenen Gene in den Patienten mittels quantitativer Realtime Polymerase Kettenreaktion untersucht. Anschließend wurde ein bezüglich Wachstumsstörungen gesundes Patientenkollektiv von 382 Individuen auf die identifizierten Varianten durchsucht. Für zwei Kandidatengene erfolgte zudem eine Mutationssuche bei weiteren Patienten mit bislang idiopathischer Wachstumsstörung aus einem internen Patientenkollektiv. Ergebnisse und Beobachtungen Durch Exomsequenzierung und anschließende Sanger-Bestätigung konnten bei den zwölf untersuchten Familien 30 Varianten ermittelt werden. Nach der Bewertung der Varianten durch computergestützte Analysen und Charakterisierung der Proteinfunktion der entsprechenden Gene konnten 14 potentiell krankheitsverursachende Varianten in neunGenen und acht Familien identifiziert werden. Bei drei Patienten konnten seltene, mit Kleinwuchs einhergehende Erkrankungen anhand der identifizierten Mutationen festgestellt werden (Kniest-Dysplasie, Mulibrey-Nanism, Hypertensions- und Brachydaktylie-Syndrom). Bei drei weiteren Patienten konnten Varianten in Kandidatengenen identifiziert werden. Das Gen MCF2L kodiert für ein überwiegend neuronal exprimiertes Onkogen und zeigte bei der Patientin eine erhöhte Expression auf mRNA-Ebene. Das Gen ARID4A ist in die Regulation der Zellproliferation involviert. Das Gen EIF3G wurde aufgrund der Ergebnisse der funktionellen Analysen und der Genfunktion mit Beteiligung an der Translationsinitiation von Proteinen als besonders interessantes Kandidatengen eingestuft. Eine Beeinträchtigung dieser Funktionen könnte zu einem gestörten Zellwachstum oder einer Signalwegstörung führen. Um eine Assoziation zwischen den Wachstumsphänotypen der Patienten und den Varianten in den Kandidatengenen zu bestätigen, müssten weitere Patienten mit Varianten in den entsprechenden Genen identifiziert werden oder weiterführende funktionelle Analysen durchgeführt werden. Schlussfolgerungen Zusammenfassend konnte durch diese Arbeit gezeigt werden, dass die Exomsequenzierung eine geeignete Methode zur Identifizierung genetischer Ursachen für Wachstumsstörungen und zur Detektion potentiell wachstumsrelevanter Gene darstellt. Weiterhin kann die Identifikation eines in der Regel seltenen genetischen Krankheitsbildes bei Patienten mit idiopathischer Wachstumsstörung therapeutische Konsequenzen im Sinne von Vorsorgeuntersuchungen oder spezifischen Therapien implizieren. Dies konnte am Beispiel des Mulibrey-Nanism mit einem erhöhtem Risiko für Neoplasien und kardiale Erkrankungen und des Hypertonie- und Brachydaktylie- Syndroms mit unbehandelt schwerer arterieller Hypertonie dargestellt werden

Identification and characterization of genetic causes of growth disorders

Hintergrund und Ziele Wachstumsstörungen werden durch das Abweichen des Höhenwachstums eines heranwachsenden Menschen von der Norm charakterisiert. Von einer Wachstumsverzögerung spricht man, wenn die Körperhöhe, bezogen auf die jeweilige Population, unterhalb der 3. Perzentile der Norm oder mehr als zwei Standardabweichungen unter dem Mittelwert des genetischen Zielbereichs einer Population liegt. Daher stellt Kleinwuchs eine häufige Fragestellung in der Pädiatrie und der humangenetischen Beratung dar. Obgleich Wachstum und Körperhöhe mit einer hohen Heretabilität von 80 bis 90 % einhergehen, kann die genetische Ursache des Kleinwuchses bei einem Großteil der Betroffenen bislang nicht aufgedeckt werden. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Identifizierung ursächlicher genetischer Veränderungen idiopathischer Wachstumsstörungen bei Patienten mittels Exomsequenzierung. Methoden (Patienten, Material und Untersuchungsmethoden) Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwölf nicht-konsanguine Familien mit betroffenen Kindern auf seltene Varianten als mögliche krankheitsverursachende Mutationen untersucht. Dazu wurde das Exom aller gesunden Elternpaare und Patienten mittels Next Generation Sequencing auf genetische Veränderungen durchsucht. Durch Sanger-Sequenzierung validierte Varianten wurden durch computergestütze Analysen und anhand ihrer Proteinfunktion bewertet. Für die vielversprechenden Kandidatengene wurden ein alternatives Splicen durch reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (rt-PCR) und die Expression der betroffenen Gene in den Patienten mittels quantitativer Realtime Polymerase Kettenreaktion untersucht. Anschließend wurde ein bezüglich Wachstumsstörungen gesundes Patientenkollektiv von 382 Individuen auf die identifizierten Varianten durchsucht. Für zwei Kandidatengene erfolgte zudem eine Mutationssuche bei weiteren Patienten mit bislang idiopathischer Wachstumsstörung aus einem internen Patientenkollektiv. Ergebnisse und Beobachtungen Durch Exomsequenzierung und anschließende Sanger-Bestätigung konnten bei den zwölf untersuchten Familien 30 Varianten ermittelt werden. Nach der Bewertung der Varianten durch computergestützte Analysen und Charakterisierung der Proteinfunktion der entsprechenden Gene konnten 14 potentiell krankheitsverursachende Varianten in neunGenen und acht Familien identifiziert werden. Bei drei Patienten konnten seltene, mit Kleinwuchs einhergehende Erkrankungen anhand der identifizierten Mutationen festgestellt werden (Kniest-Dysplasie, Mulibrey-Nanism, Hypertensions- und Brachydaktylie-Syndrom). Bei drei weiteren Patienten konnten Varianten in Kandidatengenen identifiziert werden. Das Gen MCF2L kodiert für ein überwiegend neuronal exprimiertes Onkogen und zeigte bei der Patientin eine erhöhte Expression auf mRNA-Ebene. Das Gen ARID4A ist in die Regulation der Zellproliferation involviert. Das Gen EIF3G wurde aufgrund der Ergebnisse der funktionellen Analysen und der Genfunktion mit Beteiligung an der Translationsinitiation von Proteinen als besonders interessantes Kandidatengen eingestuft. Eine Beeinträchtigung dieser Funktionen könnte zu einem gestörten Zellwachstum oder einer Signalwegstörung führen. Um eine Assoziation zwischen den Wachstumsphänotypen der Patienten und den Varianten in den Kandidatengenen zu bestätigen, müssten weitere Patienten mit Varianten in den entsprechenden Genen identifiziert werden oder weiterführende funktionelle Analysen durchgeführt werden. Schlussfolgerungen Zusammenfassend konnte durch diese Arbeit gezeigt werden, dass die Exomsequenzierung eine geeignete Methode zur Identifizierung genetischer Ursachen für Wachstumsstörungen und zur Detektion potentiell wachstumsrelevanter Gene darstellt. Weiterhin kann die Identifikation eines in der Regel seltenen genetischen Krankheitsbildes bei Patienten mit idiopathischer Wachstumsstörung therapeutische Konsequenzen im Sinne von Vorsorgeuntersuchungen oder spezifischen Therapien implizieren. Dies konnte am Beispiel des Mulibrey-Nanism mit einem erhöhtem Risiko für Neoplasien und kardiale Erkrankungen und des Hypertonie- und Brachydaktylie- Syndroms mit unbehandelt schwerer arterieller Hypertonie dargestellt werden.Objectives Growth disorders are characterized as deviation of body height of an individual from age related standards. Growth retardation is specified by body height under the 3rd percentile or more than two standard deviations below the average of the genetic target range of a defined population. Therefore growth retardation and disorders present a common medical issue in pediatric and human genetic counselling. Although growth and body height are associated with a high heritability of 80 to 90 %, the underlying genetic cause of short stature cannot be detected in the majority of affected individuals. The objective of this thesis was the identification of causal mutations in individuals with idiopathic growth disorders by exome sequencing. Design and Methods Twelve non-consanguineous families with affected children were analyzed in order to identify rare variants as possibly underlying genetic cause. Therefore exome sequencing of all affected individuals and their parents was performed. All variants confirmed by Sanger sequencing were further categorized by computer-based prediction analysis and evaluation of the protein function of the associated gene. For the resulting candidate genes I performed reverse transcription polymerase chain reaction (rt-PCR) in order to determine alternative splicing and expression analysis in the patients by quantitative Real-Time PCR (qPCR). Thereafter a control group of 382 individuals was screened for the presence of the identified variants. For two candidate genes a patient cohort with idiopathic growth disorders was examined in order to identify further mutations. Observations and Results By performing exome sequencing and Sanger confirmation I was able to identify 30 variants in twelve families. After characterization of the variants by computer-based prediction analysis and protein function of the corresponding genes 14 potentially pathogenic variants in nine genes and eight families remained. In three individuals I was able to determine rare growth disorders associated with the affected genes (Kniest dysplasia, Mulibrey nanism, hypertension and brachydaktyly syndrome). In three further patients we identified variants in candidate genes. MCF2L encodes an oncogene, that is predominantly expressed in neuronal tissue and showed elevated expression levels in the patient. ARID4A is a gene involved in the regulation of cell proliferation. EIF3G gene was further pursued due to the results of the functional analyses and its role in translation initiation of proteins.Impairment of this function could lead to alteration of cell growth or signaling pathways. In order to determine the pathogenicity of the identified variants and associated genes more patients with variants in these genes need to be identified and further functional experiments have to be performed. Conclusions I was able to underline the importance of exome sequencing as an appropriate method to identify causative and possibly pathogenic variants in individuals with idiopathic growth disorders. Furthermore the identification of rare genetic growth disorders can have therapeutic consequences like surveillance or specific therapy. This could be demonstrated for Mulibrey nanism where affected individuals have an elevated risk for neoplasia and cardiac disease as well as for hypertension and brachydaktyly syndrome which is associated with severe hypertension