Quantifying absolute addressability in DNA origami with molecular resolution

Self-assembled DNA nanostructures feature an unprecedented addressability with sub-nanometer precision and accuracy. This addressability relies on the ability to attach functional entities to single DNA strands in these structures. The efficiency of this attachment depends on two factors: incorporation of the strand of interest and accessibility of this strand for downstream modification. Here we use DNA-PAINT super-resolution microscopy to quantify both incorporation and accessibility of all individual strands in DNA origami with molecular resolution. We find that strand incorporation strongly correlates with the position in the structure, ranging from a minimum of 48% on the edges to a maximum of 95% in the center. Our method offers a direct feedback for the rational refinement of the design and assembly process of DNA nanostructures and provides a long sought-after quantitative explanation for efficiencies of DNA-based nanomachines

Complex multicomponent patterns rendered on a 3D DNA-barrel pegboard

DNA origami, in which a long scaffold strand is assembled with a many short staple strands into parallel arrays of double helices, has proven a powerful method for custom nanofabrication. However, currently the design and optimization of custom 3D DNA-origami shapes is a barrier to rapid application to new areas. Here we introduce a modular barrel architecture, and demonstrate hierarchical assembly of a 100 megadalton DNA-origami barrel of similar to 90nm diameter and similar to 250nm height, that provides a rhombic-lattice canvas of a thousand pixels each, with pitch of similar to 8nm, on its inner and outer surfaces. Complex patterns rendered on these surfaces were resolved using up to twelve rounds of Exchange-PAINT super-resolution microscopy. We envision these structures as versatile nanoscale pegboards for applications requiring complex 3D arrangements of matter, which will serve to promote rapid uptake of this technology in diverse fields beyond specialist groups working in DNA nanotechnology

Advancing and applying Next-Generation DNA-based super-resolution microscopy

Der Beginn von Superauflösungsmikroskopie hat den räumlichen Auflösungsbereich von Lichtmikroskopie hin zu molekularer Auflösung erweitert. Speziell im Bereich der Biologie ermöglicht diese bemerkenswerte Auflösung Forschern einzelne Moleküle (z.B. Proteine) in Zellen mit Hilfe von Lichtmikroskopie sichtbar zu machen. Verschiedene Techniken zur Umgehung des Beugungslimits wurden unabhängig voneinander entwickelt. Die bekanntesten Techniken sind Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy, Photo Activated Localization Microscopy (PALM), Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM), und Point Accumulation In Nanoscale Topography (PAINT). Kürzlich wurden DNA-Moleküle für die PAINT Methode verwendet, was zur Entwicklung von DNA-PAINT geführt hat. Aufgrund der einzigartigen Programmierbarkeit von DNA und der Möglichkeit Interaktionen transient und repetitiv zu gestalten, ermöglicht DNA-PAINT sehr hohe räumliche Auflösung (zur Zeit die höchste Auflösung in Lichtmikroskopie), spektral unlimitiertes Multiplexen und die Fähigkeit, quantitativ Zielmoleküle in dichten Populationen zu zählen, bei denen es schwierig ist, jedes einzelne Molekül aufzulösen. Der Inhalt dieser Arbeit beschreibt die Anwendung und Weiterentwicklung des Konzepts DNA Moleküle als intelligente Proben für Einzelmolekül-basierende Superauflösungsmikroskopie zu verwenden. Im ersten Teil wird DNA-PAINT als Tool verwendet, um die Adressierbarkeit und die Einbaueffizienz von einzelnen DNA Strängen in eine zweidimensionale DNA-Origami Struktur mit molekularer Auflösung zu bestimmen. Im zweiten Teil, wird das Konzept des kürzlich entwickelten Exchange- PAINT für spektral nicht limitiertes Aufnehmen von verschiedenen Zielmolekülen erweitert für andere Superauflösungstechniken wie STORM, STED oder SIM. Ferner wird dieses Konzept auf konventionelle und konfokale Lichtmikroskopie angewandt. Im dritten Teil werden genetisch kodierte Sonden wie SNAP- oder Halo-Tag für DNA-PAINT eingeführt. Zusätzlich werden genetisch kodierte GFP-Proteine verwendet, die dann mit einem Nanokörper markiert werden. Die Kombination dieser „Tags“ mit DNA-PAINT wird dann verwendet, um die molekulare Architektur von Kernporen zu untersuchen. Dies erlaubt, einzelne Kopien von NUP96-Proteinen in einzelnen Kernporen mit einem Abstand von nur ~12 nm aufzulösen. Der vierte Teil kombiniert Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie mit DNA-PAINT, um den räumlichen Arbeitsbereich von DNA-PAINT von nah am Deckglas bis hin zu ganzen Zellen und möglicherweise Gewebeproben zu erweitern. Im letzten Teil wird die Abtastgeschwindigkeit und damit der Aufnahmegeschwindigkeit von DNA-PAINT durch die Optimierung der Puffer und der Hybridisationssequenz zwischen der Fluoreszenzprobe und der Bindestelle am Zielmolekül erhöht.The advent of super-resolution microscopy has extended the spatial resolution of light microscopy to the molecular scale. Especially in biology, this remarkable achievement enables researchers to visualize single target molecules (e.g. proteins) in cells with all-optical microscopy. In the last decades, a plethora of techniques aimed at breaking the diffraction limit have been developed. The most famous approaches are Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy, Photo Activated Localization Microscopy (PALM), Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM), and Point Accumulation In Nanoscale Topography (PAINT). More recently, DNA molecules have been used for PAINT microscopy, leading to the development of DNA-PAINT. Due to the unique programmability of DNA molecules and their transient, yet repetitive interactions, DNA-PAINT allows for very high spatial resolution (highest thus far achieved by light microscopy), spectrally unlimited multiplexing, and the ability to quantitatively count molecules of interest in dense clusters, which are challenging to resolve. Work in this thesis applies and further develops the concept of using DNA molecules as smart probes for super-resolution microscopy. In the first part, DNA-PAINT is used as a tool to characterize the accessibility and incorporation efficiency of individual strands in a two-dimensional DNA origami nanostructure with molecular resolution. In the second part, the concept of Exchange-PAINT, a recently developed technique for spectrally-unlimited sequential multiplexing, is extended to other super-resolution techniques such as STED, STORM and SIM. In addition, the exchange concept is expanded to conventional and confocal microscopy as well. The approach is quantitatively assayed using DNA origami structures and subsequently applied to cellular imaging. In the third part, genetically-encoded tags like SNAP tag and Halo tag are introduced for DNA-PAINT imaging. Additionally, geneticallyencoded GFP proteins tagged via a nanobody are developed for DNA-PAINT. The combination of genetically-encoded tags and DNA-PAINT is used to investigate the molecular architecture of the nuclear pore complex (NPC). This enabled imaging of single copies of NUP107 proteins in single NPCs with a distance of ~12 nm. The fourth part combines spinning disk confocal microscopy hardware with DNA-PAINT in order to extend its spatial imaging range from close to the coverslip to whole cells and potentially tissues. Finally, in the last part, the sampling and thus imaging speed of DNA-PAINT is increased by an order of magnitude by buffer optimization and rational probe sequence design

Advancing and applying Next-Generation DNA-based super-resolution microscopy

Der Beginn von Superauflösungsmikroskopie hat den räumlichen Auflösungsbereich von Lichtmikroskopie hin zu molekularer Auflösung erweitert. Speziell im Bereich der Biologie ermöglicht diese bemerkenswerte Auflösung Forschern einzelne Moleküle (z.B. Proteine) in Zellen mit Hilfe von Lichtmikroskopie sichtbar zu machen. Verschiedene Techniken zur Umgehung des Beugungslimits wurden unabhängig voneinander entwickelt. Die bekanntesten Techniken sind Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy, Photo Activated Localization Microscopy (PALM), Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM), und Point Accumulation In Nanoscale Topography (PAINT). Kürzlich wurden DNA-Moleküle für die PAINT Methode verwendet, was zur Entwicklung von DNA-PAINT geführt hat. Aufgrund der einzigartigen Programmierbarkeit von DNA und der Möglichkeit Interaktionen transient und repetitiv zu gestalten, ermöglicht DNA-PAINT sehr hohe räumliche Auflösung (zur Zeit die höchste Auflösung in Lichtmikroskopie), spektral unlimitiertes Multiplexen und die Fähigkeit, quantitativ Zielmoleküle in dichten Populationen zu zählen, bei denen es schwierig ist, jedes einzelne Molekül aufzulösen. Der Inhalt dieser Arbeit beschreibt die Anwendung und Weiterentwicklung des Konzepts DNA Moleküle als intelligente Proben für Einzelmolekül-basierende Superauflösungsmikroskopie zu verwenden. Im ersten Teil wird DNA-PAINT als Tool verwendet, um die Adressierbarkeit und die Einbaueffizienz von einzelnen DNA Strängen in eine zweidimensionale DNA-Origami Struktur mit molekularer Auflösung zu bestimmen. Im zweiten Teil, wird das Konzept des kürzlich entwickelten Exchange- PAINT für spektral nicht limitiertes Aufnehmen von verschiedenen Zielmolekülen erweitert für andere Superauflösungstechniken wie STORM, STED oder SIM. Ferner wird dieses Konzept auf konventionelle und konfokale Lichtmikroskopie angewandt. Im dritten Teil werden genetisch kodierte Sonden wie SNAP- oder Halo-Tag für DNA-PAINT eingeführt. Zusätzlich werden genetisch kodierte GFP-Proteine verwendet, die dann mit einem Nanokörper markiert werden. Die Kombination dieser „Tags“ mit DNA-PAINT wird dann verwendet, um die molekulare Architektur von Kernporen zu untersuchen. Dies erlaubt, einzelne Kopien von NUP96-Proteinen in einzelnen Kernporen mit einem Abstand von nur ~12 nm aufzulösen. Der vierte Teil kombiniert Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie mit DNA-PAINT, um den räumlichen Arbeitsbereich von DNA-PAINT von nah am Deckglas bis hin zu ganzen Zellen und möglicherweise Gewebeproben zu erweitern. Im letzten Teil wird die Abtastgeschwindigkeit und damit der Aufnahmegeschwindigkeit von DNA-PAINT durch die Optimierung der Puffer und der Hybridisationssequenz zwischen der Fluoreszenzprobe und der Bindestelle am Zielmolekül erhöht.The advent of super-resolution microscopy has extended the spatial resolution of light microscopy to the molecular scale. Especially in biology, this remarkable achievement enables researchers to visualize single target molecules (e.g. proteins) in cells with all-optical microscopy. In the last decades, a plethora of techniques aimed at breaking the diffraction limit have been developed. The most famous approaches are Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy, Photo Activated Localization Microscopy (PALM), Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM), and Point Accumulation In Nanoscale Topography (PAINT). More recently, DNA molecules have been used for PAINT microscopy, leading to the development of DNA-PAINT. Due to the unique programmability of DNA molecules and their transient, yet repetitive interactions, DNA-PAINT allows for very high spatial resolution (highest thus far achieved by light microscopy), spectrally unlimited multiplexing, and the ability to quantitatively count molecules of interest in dense clusters, which are challenging to resolve. Work in this thesis applies and further develops the concept of using DNA molecules as smart probes for super-resolution microscopy. In the first part, DNA-PAINT is used as a tool to characterize the accessibility and incorporation efficiency of individual strands in a two-dimensional DNA origami nanostructure with molecular resolution. In the second part, the concept of Exchange-PAINT, a recently developed technique for spectrally-unlimited sequential multiplexing, is extended to other super-resolution techniques such as STED, STORM and SIM. In addition, the exchange concept is expanded to conventional and confocal microscopy as well. The approach is quantitatively assayed using DNA origami structures and subsequently applied to cellular imaging. In the third part, genetically-encoded tags like SNAP tag and Halo tag are introduced for DNA-PAINT imaging. Additionally, geneticallyencoded GFP proteins tagged via a nanobody are developed for DNA-PAINT. The combination of genetically-encoded tags and DNA-PAINT is used to investigate the molecular architecture of the nuclear pore complex (NPC). This enabled imaging of single copies of NUP107 proteins in single NPCs with a distance of ~12 nm. The fourth part combines spinning disk confocal microscopy hardware with DNA-PAINT in order to extend its spatial imaging range from close to the coverslip to whole cells and potentially tissues. Finally, in the last part, the sampling and thus imaging speed of DNA-PAINT is increased by an order of magnitude by buffer optimization and rational probe sequence design