ErbB2/HER2-specific NK cells for adoptive cancer immunotherapy

Poster presentation: 28th Annual Scientific Meeting of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC) Significant progress has been made over the last decade towards realizing the potential of natural killer (NK) cells for cancer immunotherapy. NK cells can respond rapidly to transformed and stressed cells, and have the intrinsic potential to extravasate and reach their targets in almost all body tissues. In addition to donor-derived primary NK cells, also continuously expanding cytotoxic cell lines such as NK-92 are being considered for adoptive cancer immunotherapy. High cytotoxicity of NK-92 has previously been shown against malignant cells of hematologic origin in preclinical studies, and general safety of infusion of NK-92 cells has been established in phase I clinical trials. To enhance their therapeutic utility, we genetically modified NK-92 cells to express chimeric antigen receptors (CAR) specific for tumor-associated surface antigens. Such CAR were composed of a tumor-specific scFv antibody fragment fused via hinge and transmembrane domains to intracellular signaling moieties such as CD3 zeta chain, or composite fusion molecules also containing a costimulatory protein domain in addition to CD3 zeta. For development towards clinical applications, here a codon-optimized second generation CAR was constructed that consists of an ErbB2-specific scFv antibody domain fused via a linker to a composite CD28-CD3 zeta signaling domain. GMP-compliant protocols for vector production, lentiviral transduction and expansion of a genetically modified NK-92 single cell clone (NK-92/5.28.z) were established. Functional analysis of NK-92/5.28.z cells revealed high and stable CAR expression, selective cytotoxicity against ErbB2-expressing but otherwise NK-resistant tumor cells of different origins in vitro, as well as homing to ErbB2-expressing tumors in vivo. Furthermore, antigen specificity and selective cytotoxicity of these cells were retained in vivo, resulting in antitumoral activity against subcutaneous and intracranial glioblastoma xenografts in NSG mice. Ongoing work now focuses on the development of these cells for adoptive immunotherapy of ErbB2-positive glioblastoma

Untersuchungen zur Analyse der Funktion und des Migrationsverhaltens von humanen und murinen regulatorischen T-Zellen (Tregs)

Einige Teilergebnisse dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Mahnke K., Schönfeld K., Fondel S. et al (2007), Int. J. Cancer 120; 2723-2733 Depletion of CD4+CD25+ human regulatory T cells in vivo: Kinetics of Treg depletion and alterations in immune functions in vivo and in vitro Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Treg depletierende Wirkung von ONTAK, einem Fusionsprotein aus Interleukin-2 und Diphterietoxin, untersucht. Hierzu wurde ONTAK in Zellkultur auf humanen Lymphozyten getestet und anschließend Melanomapatienten verabreicht. ONTAK konnte sowohl in vitro als auch in vivo eine Depletion von Tregs induzieren, wenngleich der in vivo Effekt nicht vollständig war. Des Weiteren wurde der immunologische Effekt, der auf die Reduktion der Tregs zurückzuführen ist, untersucht. Hierzu wurden die Patienten mit DCP behandelt, welches normalerweise zu einer schwachen Entzündungsreaktion führt. Nach Treg Depletion wurden starke Kontaktekzeme in den Patienten induziert. Aufgrund dieser verstärkten Immunantwort erfolgte eine Applikation der Tumorpeptide MART1 und gp100 in das Kontaktekzem. Anschließend konnten peptidspezifische CD8 T-Zell Populationen detektiert werden, die sowohl INF-γ sekretierten, als auch zytotoxisch aktiv waren. Solche starken Immunantworten wurden bisher nur unter zu Hilfenahme starker Adjuvanzien induziert. ONATK führt bereits nach einmaliger Applikation zu einer Depletion regulatorischer T-Zellen in vivo. Dabei wird der Gehalt von 4 % regulatorischen T-Zellen im Blut auf einen Gehalt von 1 % gesenkt. Diese Depletion der Tregs verstärkt eine Immunisierung mit Peptiden, die eine starke CD8 T-Zell vermittelte Immunantwort induziert. Allerdings kam es zu keiner vollständigen Depletion der Tregs, was durch die geringe in vivo Halbwertszeit von ONTAK, sowie durch unbekannte Mechanismen der Treg Homöostase erklärt werden könnte. Die Wirkweise von ONTAK konnte nur im Blut, aber nicht in anderen Organen wie z.B. Lymphknoten erforscht werden, daher besteht die Möglichkeit, einer unvollständigen Depletion der Zellen in peripheren Organen. In wieweit Tregs im Blut mit anderen Zellen wechselwirken ist weitgehenst unerforscht. Die meisten Untersuchungen zeigen Zell-Zell Interaktionen in den Lymphknoten und im entzündeten Gewebe. Der Ort, an dem die Tregs aber wirklich ihr suppressives Potential auf andere Zellen entfalten, ist noch unbekannt. Hiermit beschäftigt sich der zweite Teil dieser Arbeit. Zur Beantwortung dieser Frage sollten Tregs in vivo in Mäusen in die Haut oder den Lymphknoten geleitet werden. Um das Vorhaben auszuführen, wurden die Zytokinrezeptoren CCR7, CCR9 und CCR10 sowie die Adhäsionsmoleküle PSGL-1, ESL-1 und CD103 kloniert und in zwei Expressionssystemen getestet. Ein lentivirales System zeigte eine schlechte Transduktionseffizienz, so dass ein zweites System mit einer Elektroporationstechnik, der Nucleofection gewählt wurde. Dieses führte zu Expressionseffizienzen von ca. 40 %. Zuerst wurde die Funktionalität der klonierten Moleküle in vitro in der murinen T-Zellline EL-4 in Transwell- und Flowchamberversuchen demonstriert, anschließend wurden murine in vitro expandierte Tregs nucleofiziert. Eine umfassende Analyse der nucleofizierten Zellen zeigte eine Heraufregulation von CD69 und eine Herunteregulation von CD62L, was auf eine Aktivierung der Zellen deutet. Mit einhergehender Aktivierung nahm auch die Apoptoserate der Zellen zu, diese konnte auch durch Modifikationen der Nucleofections- sowie der Kulturbedingungen nicht verringert werden. Nach einer Inkubationszeit von 16 Stunden nach der Nucleofection ließen sich noch adhäsive Eigenschaften der exprimierten Moleküle in der Flowchamber nachweisen. Im Suppressionstest, in dem die Zellen über einen Zeitraum von drei Tagen inkubiert wurden, waren die Zellen jedoch nicht mehr suppressiv. Daher wären die in vivo Versuche, die den suppressiven Einfluß der Tregs auf die Ohrschwellung in Abhängigkeit ihrer Lokalisation untersuchen sollten, erfolglos geblieben. Mit der Induktion der Apoptose stießen die hier verwendeten Methoden an ihre Grenzen. Zur Realisierung des Projekts müssten andere Transduktionssysteme oder Tregs aus knock out Mäusen verwendet werden. Regulatorische T-Zellen nehmen eine Schlüsselrolle bei der Suppression von anti-Tumor Immunantworten aber auch bei dem Schutz vor Autoimmunerkrankungen ein. Eine erfolgreiche Manipulation dieser Zellen in vivo oder in vitro bildet eine solide Basis für neuartige Immuntherapien gegen entsprechende Krankheiten. ONTAK ist ein wirkungsvolles Medikament, um die Anzahl der regulatorischen Zellen in vvo zu reduzieren. Es trägt dadurch zu einer verstärkten Immunantwort bei. Eine einmalige Gabe von ONTAK ist sicherlich nicht ausreichend, um Tumore zu bekämpfen, es kann aber Immuntherapien unterstützen. Eine Manipulation von Tregs, durch die Expression von Transgenen um ihr Migrationsverhalten in vivo zu beeinflussen und damit die Suppression von Autoimmunerkrankungen zu bedingen, ist noch nicht ausgereift und bedarf noch weiterer Forschung

All nBT062 model variants are internalized <i>in vitro</i>.

<p>(A) Schematic overview of measured binding/internalization status of fluorescent labeled antibodies. (B) Flow cytometric internalization analysis of WT nBT062, stable nBT062, half nBT062 and bispecific nBT062-natalizumab. CD49d was blocked by 50x excess of unlabeled natalizumab. Data represent median fluorescence intensity values of at least three separate experiments. Column colors represent antibody location as shown in (A). ****p<0.0001, ***p<0.001. (C) Fluorescence microscopy of BaF3-hCD138 (CD138⁺) cells (I-V) or BaF3 (CD138^-) control cells (VI) incubated for 3h with indicated Dylight-448 labeled nBT062 model antibodies or natalizumab (green, a). Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) is shown in red (b), nucleus is shown in blue (c). Respective overlay pictures are demonstrated (d).</p

Antibody binding affinities towards BaF3-hCD138 (CD138⁺/CD49d^-) and Jurkat (CD138^-/CD49d⁺) cells calculated from binding curves of Fig 3.

<p>Antibody binding affinities towards BaF3-hCD138 (CD138⁺/CD49d^-) and Jurkat (CD138^-/CD49d⁺) cells calculated from binding curves of <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0195823#pone.0195823.g003" target="_blank">Fig 3</a>.</p

Half-antibody exchange preventing mutations of nBT062-DM4 models improve the tumor growth inhibition in the presence of human IgG against CD138⁺ human mammary carcinoma xenografts in NMRI nude mice.

<p>Mice bearing established xenograft tumors were treated with three once weekly i.v. injections (indicated by arrows) of WT nBT062-DM4, stable nBT062-DM4, half nBT062-DM4 and bispecific nBT062-natalizumab-DM4 either alone or in combination with a 10% intravenous immunoglobulin G (IVIg) preparation administered i.v. 10 ml/kg/week. PBS was used as vehicle control and IVIg was also tested as monotherapy. The nBT062-DM4 model variants were tested using doses of 4 mg/kg/week or 2 mg/kg/week.</p

Schematic half antibody exchange and respective nBT062 model antibodies.

<p>(A) Overview of <i>in vivo</i> IgG4 half antibody exchange mainly driven by the potential to form either interchain or intrachain disulfide bonds in the hinge region. A S228P mutation increases the sterical distance of the two cysteines preventing intrachain disulfide bonds. (B) Generated nBT062 model antibodies: Wild type (WT) nBT062, stable nBT062, half nBT062 and bispecific nBT062-natalizumab. Respective mutations are indicated.</p

nBT062-DM4 model variants kill CD138⁺ NCI-H929 tumor cells <i>in vitro</i>.

<p>NCI-H929 cells (CD138⁺/CD49d⁺) were incubated for 5 days with varying concentrations of WT nBT062-DM4, stable nBT062-DM4, half nBT062-DM4 and bispecific nBT062-natalizumab-DM4 antibodies. Natalizumab was used for CD49d blocking. Reciprocal IC₅₀ values of each antibody-drug conjugate were normalized to WT nBT062-DM4 and one DM4 molecule per antibody. Results are shown from three separate experiments each measured in triplicates. *p<0.05, **p<0.01.</p

All nBT062 model variants are internalized <i>in vitro</i>.

<p>(A) Schematic overview of measured binding/internalization status of fluorescent labeled antibodies. (B) Flow cytometric internalization analysis of WT nBT062, stable nBT062, half nBT062 and bispecific nBT062-natalizumab. CD49d was blocked by 50x excess of unlabeled natalizumab. Data represent median fluorescence intensity values of at least three separate experiments. Column colors represent antibody location as shown in (A). ****p<0.0001, ***p<0.001. (C) Fluorescence microscopy of BaF3-hCD138 (CD138⁺) cells (I-V) or BaF3 (CD138^-) control cells (VI) incubated for 3h with indicated Dylight-448 labeled nBT062 model antibodies or natalizumab (green, a). Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) is shown in red (b), nucleus is shown in blue (c). Respective overlay pictures are demonstrated (d).</p