IKKβ kinase promotes stemness, migration, and invasion in KRAS-driven lung adenocarcinoma cells

KRAS oncogenic mutations are widespread in lung cancer and, because direct targeting of KRAS has proven to be challenging, KRAS-driven cancers lack effective therapies. One alternative strategy for developing KRAS targeted therapies is to identify downstream targets involved in promoting important malignant features, such as the acquisition of a cancer stem-like and metastatic phenotype. Based on previous studies showing that KRAS activates nuclear factor kappa-B (NF-κB) through inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase β (IKKβ) to promote lung tumourigenesis, we hypothesized that inhibition of IKKβ would reduce stemness, migration and invasion of KRAS-mutant human lung cancer cells. We show that KRAS-driven lung tumoursphere-derived cells exhibit stemness features and increased IKKβ kinase activity. IKKβ targeting by different approaches reduces the expression of stemness-associated genes, tumoursphere formation, and self-renewal, and preferentially impairs the proliferation of KRAS-driven lung tumoursphere-derived cells. Moreover, we show that IKKβ targeting reduces tumour cell migration and invasion, potentially by regulating both expression and activity of matrix metalloproteinase 2 (MMP2). In conclusion, our results indicate that IKKβ is an important mediator of KRAS-induced stemness and invasive features in lung cancer, and, therefore, might constitute a promising strategy to lower recurrence rates, reduce metastatic dissemination, and improve survival of lung cancer patients with KRAS-driven disease

The role of Aurora A kinase in the biology of lung tumor initiating cells with KRAS mutations

Mutações ativadoras no gene KRAS são prevalentes em cancer de pulmão e a as vias de sinalização de RAS estão aumentadas em células iniciadoras de tumor (CITs), que são definidas como células autorrenováveis capazes de iniciar a formação tumoral, sustentar o crescimento tumoral e promover a disseminação tumoral. Entretanto, terapias direcionadas a RAS não foram efetivas até hoje e a identificação de alvos de KRAS que contribuam para o fenótipo oncogênico é necessária. Como a quinase Aurora A (AURKA) já foi implicada, tanto na oncogênese induzida por KRAS, quanto em promover a função das CITs, nós hipotetizamos que a inibição das vias de AURKA seria detrimental para a função de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica, desta forma diminuindo o comportamento maligno do câncer de pulmão. Para avaliar a função das CITs, nós usamos ensaios de crescimento de tumoresferas que permitem o crescimento seletivo de CITs in vitro. As linhagens pulmonares positivas para KRAS H358 e A549 formaram tumoresferas em cultura de baixa aderência e, quando comparadas às linhagens parentais, às células oriundas de tumoresferas apresentaram maior capacidade clonogênica in vitro e maior tumorigenicidade in vivo. Além disso, uma análise por qPCR revelou que as células oriundas de tumoresferas possuem expressão aumentada de fatores de células tronco, uma característica de CITs. Em seguida, nós inibimos a AURKA nas linhagens pulmonares positivas para KRAS H358 e A549 por interferência de RNA (RNAi) ou com um inibidor das quinases Aurora (AI II). A inibição de AURKA diminuiu a formação de tumoresferas e o crescimento destas em culturas seriadas, além de reduzir a capacidade clonogênica das células oriundas de tumoresferas. Estes resultados indicam que a AURKA é importante para a autorrenovação e a oncogenicidade de CITs, e que a AURKA induz o fenótipo tronco-tumoral, o que é corroborado pelo achado de que a inibição de AURKA nas tumoresferas reduz a expressão de fatores de célula tronco. Um destes fatores regulados por AURKA é o marcador de superfície de célula tronco CD24. De fato, quando comparadas às células cultivadas de forma aderente, as células oriundas de tumoresferas apresentam maior número de células positivas para CD24 (CD24+) e estes números são reduzidos pelo tratamento com AI II. Finalmente, nós purificamos células H358 CD24+ por citometria de fluxo e mostramos que, quando comparadas às células negativas para CD24, as células CD24+ apresentam maior capacidade de formar tumoresferas em culturas seriadas, e o tratamento com AI II inibe preferencialmente a capacidade de células CD24+ de formarem tumoresferas. Nossos resultados sugerem que uma terapia baseada na inibição de AURKA pode reduzir o número e função de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica e, portanto, pode representar uma estratégia terapêutica atraente para reduzir a recidiva e metástase no câncer de pulmão induzido por KRAS.Activating mutations in KRAS are prevalent in lung cancer and RAS sinaling is enhanced in cancer initiating cells (CICs), which are defined as self-renewing tumor cells able to initiate tumor formation, sustain tumor growth and drive tumor dissemination. However, therapies targeted to oncogenic RAS have been ineffective to date and identification of KRAS targets that impinge on the oncogenic phenotype is warranted. Because Aurora kinase A (AURKA) has been implicated both in RAS oncogenesis and in promoting CIC function, we hypothesized that targeting AURKA pathways would impair KRAS-positive lung CIC function, thereby decreasing lung cancer malignant behavior. To evaluate CIC function, we used tumorsphere assays that allow selective growth of CICs in vitro. KRAS positive lung cancer H358 and A549 cells formed tumorspheres under low attachment conditions, and, when compared to the parental cell lines, sphere-forming cells had increased clonogenic ability in vitro and increased tumorigenicity in vivo. In addition, qPCR analysis revealed that tumorsphere cells displayed increased expression of stem cell factors, a hallmark of CICs. Next, we targeted AURKA in KRAS positive lung cancer H358 and A549 cells by RNA interference (RNAi) or with an Aurora inhibitor (AI II). AURKA targeting decreased tumorsphere formation and growth in serial cultures and reduced clonogenic growth of tumorsphere-forming cells. These results indicate that AURKA is important for CIC selfrenewal and oncogenicity and that AURKA induces a CIC phenotype, which is further underscored by the finding that AURKA targeting in tumorspheres decreases expression of stem cell factors. One such factor shown to be regulated by AURKA is the stem cell surface marker CD24. In fact, when compared to adherent cultures, A549 and H358 tumorspheres display increased numbers of CD24-positive (CD24+) cells and these numbers are reduced by AI II treatment. Finally we purified H358 CD24+cells by flow cytometry and showed that, when compared to CD24-negative cells, CD24+ cells have increased ability to form tumorspheres in serial cultures, and AI II treatment preferentially reduced the ability of CD24+ cells to form tumorspheres. Our results suggest that AURKA inhibition therapy can reduce the number and function of KRAS-positive lung CICs, and, therefore might be an attractive therapeutic strategy to reduce recurrence and metastasis in KRAS-induced lung cancer

Exploring aurora A kinase as a therapeutic target in KRAS-induced lung Tumor Initiating Cells

O câncer de pulmão é o câncer que mais mata no mundo todo, e um dos fenótipos mais importantes da oncogênese é a aquisição e conservação de um fenótipo tronco tumoral pelas células iniciadoras de tumor (CITs), que são definidas como células tumorais autorrenováveis capazes de iniciar a formação de tumores, sustentar o crescimento tumoral, conferir quimio e radiorresistência e são responsáveis pela disseminação tumoral. A aquisição do fenótipo tronco tumoral e metastático em células tumorais pulmonares é promovida pela ativação do oncogene KRAS, sendo que mutações ativadoras em KRAS são prevalentes no câncer de pulmão. No entanto, KRAS é um alvo terapêutico pouco drogável e as terapias direcionadas à KRAS oncogênica ainda são escassas e específicas para a mutação G12C. Portanto, a identificação de alvos de KRAS envolvidos em promover o fenótipo maligno é necessária. A quinase Aurora A (AURKA) promove a oncogenicidade e tumorigenicidade das células transformadas por KRAS e também tem sido implicada na aquisição do fenótipo tronco tumoral e metastático. Portanto, nosso objetivo foi avaliar como AURKA afeta o fenótipo tronco tumoral e metastático de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica. Para isso, utilizamos células tumorais pulmonares H1703 com indução (H1703 G12V) ou não (H1703 TrexB) da expressão de KRAS oncogênica e células de câncer de pulmão H358 e A549 portadoras de mutação oncogênica em KRAS. Para avaliar o fenótipo tronco tumoral, realizamos ensaios de formação tumoresferas que permitem o crescimento seletivo de CITs in vitro e observamos que no modelo induzível a inibição de AURKA reduz a capacidade de formação de tumoresferas de maneira KRAS-dependente e nas linhagens A549 e H358 a inibição de AURKA reduz a capacidade de autorrenovação das tumoresferas. Para purificar uma população altamente enriquecida para CITs, nós avaliamos marcadores de superfície de células tronco nessas linhagens, mas não identificamos marcadores que apresentassem uma correlação com o fenótipo tronco tumoral. Como alternativa geramos células H358 e A549 com expressão estável da construção repórter para células tronco tumorais SORE6-GFP, aonde a expressão de GFP é regulada por 6 cópias do elemento de resposta aos fatores de transcrição de célula tronco SOX2 e Oct4 (SORE6). Observamos uma maior proporção de células SORE6-GFP positivas na linhagem H358, indicando que essa linhagem apresenta maior fenótipo tronco tumoral. Células oriundas de tumoresferas enriquecidas para CITs destas linhagens apresentaram maior fenótipo migratório e invasivo, sendo que a inibição de AURKA reduziu a capacidade de migração e invasão tanto das células parentais quanto das populações enriquecidas em CITs. Além disso, a inibição de AURKA na linhagem H358 reduziu a expressão dos fatores pró-angiogêncios IL-8 e VEFG e a capacidade de células endoteliais HUVEC de formarem tubos angiogênicos. A inibição de AURKA na linhagem H358 também reduziu a capacidade migratória das células HUVEC de forma dependente de IL-8 e VEGF. Nossos resultados sugerem que a terapia de inibição de AURKA pode reduzir o fenótipo tronco tumoral e metastático de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica e, portanto, pode ser uma estratégia terapêutica atraente para reduzir a recorrência e a metástase no câncer de pulmão induzido por KRAS.Lung cancer is the the leading cause of cancer deaths worldwide, and one of the most important phenotypes of oncogenesis is the acquisition and maintenance of a cancer stem-like phenotype by tumor initiating cells (TICs), which are defined as self-renewing tumor cells capable of initiating tumor formation, sustaining tumor growth, promoting chemo and radioresistance, and are responsible for tumor spread. The acquisition of a cancer stem-like and metastatic phenotype by lung cancer cells is induced by activation of the KRAS oncogene, and KRAS activating mutations are prevalent in lung cancer. However, KRAS is a poorly druggable therapeutic target and KRAStargeted therapies are scarce and sofar specific for the G12C mutation. Therefore, the identification of KRAS targets involved in promoting the malignant phenotype is warranted. Aurora A kinase (AURKA) promotes oncogenicity and tumorigenicity of KRAS-transformed cells. Furthermore, AURKA has also been implicated in the acquisition of cancer stem-like and metastatic phenotype. Therefore, our goal was to evaluate how AURKA affects the cancer stem-like and metastatic phenotype of pulmonary TICs harboring oncogenic KRAS. For that purpose, we utilized KRASinducible H1703 lung tumor cells with (H1703 G12V) or without (H1703 TrexB) induction of oncogenic KRAS and we also used KRAS-mutant H358 and A549 lung cancer cells. To evaluate the cancer stem-like phenotype, we performed tumorsphere formation assays, that allow for the selective growth of TICs in vitro, and observed that AURKA inhibition in the KRAS-induclible cell model reduces tumorsphere formation in a KRAS-dependent manner and AURKA inhibition in A549 and H358 cells reduces tumorsphere selfrenewal. To purify a population highly enriched for TICs, we analyzed stem cell surface markers in these cell lines, but we were unable to identify surface markers that correlated with the stem-like phenotype. As an alternative, we generated H358 and A549 cells stably expressing the SORE6-GFP stem cell reporter construct, where GFP expression is regulated by 6 copies of the stem cell transcription factors SOX2 and Oct4 response element (SORE6). We observed a higher percentage of SORE6-GFP positive cells in the H358 cell line, indicating that this cell line has a more pronounced stem-like phenotype. Tumorsphere-derived H358 and A549 cells enriched for TICs displayed enhanced migratory and invasive phenotype, and AURKA inhibition reduced migration and invasion of both parental and TIC-enriched cell populations. Furthermore, AURKA inhibition in H358 cells reduced expression of pro-angiogenic factors IL-8 and VEFG and the ability of HUVEC endothelial cells to form angiogenic tubes. AURKA inhibition in H358 cells also reduced HUVEC migration in an IL-8- and VEGF-dependent manner. Our results suggest that AURKA-inhibition therapy can reduce the stem-like and metastatic phenotype of lung TICs harboring oncogenic KRAS and, therefore, may represent a promising therapeutic strategy to reduce recurrence and metastasis in KRAS-induced lung cancer