Standardization and validation of molecular markers for the diagnosis of cutaneous leishmaniasis

O diagnóstico da leishmaniose tegumentar (LT) baseia-se em critérios clínicos e epidemiológicos podendo ser confirmado por exames laboratoriais de rotina como a pesquisa direta do parasito por microscopia e a intradermorreação de Montenegro. Atualmente, os métodos moleculares, principalmente a reação da cadeia da polimerase (PCR), têm sido considerados para aplicação em amostras clínicas, devido a sua alta sensibilidade e especificidade. Este trabalho teve como objetivo a padronização e validação das técnicas de PCR-RFLP com diferentes iniciadores (kDNA, its1, hsp70 e prp1), visando o diagnóstico e a identificação das espécies de Leishmania presentes em amostras de DNA provenientes de lesões de pele ou mucosa de 140 pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar. Para tal, realizamos ensaios de: 1) sensibilidade das PCRs com os diferentes iniciadores, 2) especificidade dos ensaios utilizando DNAs de diferentes espécies de referência de Leishmania, de tripanossomatídeos inferiores e de fungos, 3) validação das técnicas de PCR-RFLP com os iniciadores estudados em amostras de DNA de lesões de pele ou mucosas de pacientes com LT. Os resultados dos ensaios de limiar de detecção das PCR (sensibilidade) mostraram que os quatro iniciadores do estudo foram capazes de detectar o DNA do parasito, porém em quantidades distintas: até 500 fg com os iniciadores para kDNA e its1, até 400 fg com hsp70 e até 5 ng com prp1. Quanto à especificidade dos iniciadores, não houve amplificação dos DNAs fúngicos. Por outro lado, nos ensaios com os iniciadores para kDNA e hsp70, verificamos amplificação do fragmento esperado em amostras de DNA de tripanossomatídeos. Nos ensaios com its1 e prp1, o padrão de amplificação com os DNAs de tripanossomatídeos foi diferente do apresentado pelas espécies de Leishmania. Verificou-se nos ensaios de validação que o PCR-kDNA detectou o parasito em todas as 140 amostras de DNA de pacientes e, assim, foi utilizado como critério de inclusão das amostras. A PCR-its1 apresentou menor sensibilidade, mesmo após a reamplificação com o mesmo iniciador (85,7% ou 120/140 amostras). Para os ensaios da PCR-hsp70, as amostras de DNA foram amplificadas com Repli G, para obter uma sensibilidade de 68,4% (89/140 amostras). A PCR-prp1 não detectou o parasito em amostras de DNA dos pacientes. Quanto aos ensaios para a identificação da espécie presente na lesão, a PCR-kDNA-RFLP-HaeIII e a PCR-its1- RFLP-HaeIII permitem a distinção de L. (L.) amazonensis das outras espécies pertencentes ao subgênero Viannia. A PCR-hsp70-RFLP-HaeIII-BstUI, apesar de potencialmente ser capaz de identificar as seis espécies de Leishmania analisadas, quando utilizada na avaliação das amostras humanas permitiu apenas a identificação de L. (V.) braziliensis. No entanto, é uma técnica com várias etapas e de difícil execução, o que pode inviabilizar o seu uso rotineiro em centros de referência em diagnósticos. Assim, recomendamos o uso dessa metodologia apenas em locais onde várias espécies de Leishmania sejam endêmicas. Finalmente, os resultados indicam que o kDNA-PCR devido à alta sensibilidade apresentada e facilidade de execução pode ser empregada como exame de rotina nos centros de referência, permitindo a confirmação ou exclusão da LT.The diagnosis of cutaneous leishmaniasis is based on clinical and epidemiological criteria and can be confirmed by routine laboratory tests such as direct detection of parasites by microscopy and by Montenegro skin test. Currently, the molecular methods, especially the polymerase chain reaction (PCR) have been considered for use in clinical samples due to its high sensitivity and specificity. This study aimed to standardize and validate the PCR-RFLP techniques with different primers (kDNA, its1, hsp70 and prp1) for the diagnosis and identification of Leishmania species present in DNA samples from skin or mucosal lesions of 140 patients with suspected cutaneous leishmaniasis. The following assays were performed to evaluate the 1) sensitivity of the PCRs with different pairs of primers, 2) specificity of the markers using DNAs of various species of Leishmania, lower trypanosomatids and fungi, 3) validate the PCR-RFLP techniques with DNA samples from skin or mucosal lesions of patients with LT. The results of the PCR detection threshold tests (sensitivity) showed that the four study pairs of primers were able to detect the DNA of the parasite, but in different quantities: up to 500 fg with kDNA and its1, 400 fg with hsp70 and up to 5 ng with prp1. Regarding the specificity of the primers, no amplification was observed with fungal DNA. On the other hand, the expected fragments for kDNA and hsp70 PCR were amplified with DNA of trypanosomatids. In its1 and prp1- PCR the pattern of amplification with the DNA of trypanosomatids was different of the one observed for species of Leishmania. In validation assays of PCR-kDNA protocol the parasite was detected in all 140 DNA samples from patients and it was used as inclusion criteria of the samples. The its1-PCR showed lower sensitivity even after reamplification (85.7% or 120/140 samples). The hsp70-PCR validation test was done with DNA samples amplified with Repli G, we obtained a sensitivity of 68.4% (89/140 samples). The PCR-prp1 did not detect the parasite in DNA samples from patients. Concern the tests for the identification of species present in the lesion, PCR-RFLP kDNA-HaeIII and PCR-RFLP ITS1-HaeIII enable distinction L. (L.) amazonensis from the other species belonging to the subgenus Viannia. The PCR-RFLP hsp70-BstUI, HaeIII, although potentially able to identify the six species of Leishmania studied, when it was used in the evaluation of only human samples, it identified only L. (V.) braziliensis. However, PCR-RFLP hsp70-BstUI, HaeIII is a technique with several stages and difficult to implement, which can derail your routine use in referral centers for diagnosis. Thus, we recommend using this method only in places where various Leishmania species are endemic. Finally, our results indicate that kDNA-PCR due to the high sensitivity and ease of execution could be used as a routine examination in reference centers, allowing the confirmation or exclusion of LT

Avaliação do método de Iwatsu et al., (1981) para isolamento de leveduras negras do solo, degradadoras de hidrocarbonetos

Fungos do grupo das leveduras negras têm revelado grande potencial em degradar compostos aromáticos como únicas fontes de carbono, capacidade de sobreviver sob atmosferas contendo hidrocarbonetos e habitar nichos com baixa concentração de nutrientes. Apesar do potencial de aplicação destes nas áreas ambiental e industrial, sua ecologia é pouco conhecida e seu isolamento na natureza ainda é difícil. A técnica de flotação em óleo (IWATSU et al., 1981) é aplicada com sucesso para recuperação de leveduras negras provenientes da natureza. No entanto, os mecanismos envolvidos neste método são desconhecidos. Assim, neste trabalho, testaram-se três hipóteses de seleção da técnica: hidrofobicidade celular, assimilação de hidrocarbonetos e oligotrofismo. A metodologia foi aplicada em amostras de solo de “landfarming” da Refinaria do Planalto Paulista (REPLAN). Cepas isoladas e padrão foram submetidas aos testes para verificação das hipóteses formuladas. A hidrofobicidade celular das cepas foi verificada mediante quantificação da concentração celular da suspensão na fase oleosa após agitação com hidrocarboneto. Os testes de assimilação de hidrocarbonetos e oligotrofismo foram realizados mediante análises de curvas de crescimento obtidas por leituras de absorbância. Os resultados obtidos mostraram que o solo de “landfarming” é um local propício para o estudo de leveduras negras, uma vez que 107 cepas foram recuperadas e a análise molecular revelou uma espécie nova: Cladophialophora immunda. O teste de hidrofobicidade indicou que, a hidrofobicidade celular pode não ser o principal fator seletivo, pois espécies hidrofóbicas e hidrofílicas foram recuperadas pela técnica em estudo. A maioria das cepas de leveduras negras testadas apresentou crescimento em meio contendo hidrocarbonetos como fontes únicas de carbono,...Black yeast fungi have shown great potential to degrade aromatic hydrocarbons as single carbon source, ability to survive under atmospheres with hydrocarbons and to live in niches poor in nutrient. Despite the application potential of these fungi in the environmental and industrial areas, the knowledge about their ecology is incomplete and their isolation from nature is still difficult. The oil flotation technique (IWATSU et al., 1981) has been succeed on the black yeast strains recovery from nature, however, mechanisms involved in this method are still unknown. The present study tests three hypothesis on its selective mechanisms: cell surface hydrophobicity, hydrocarbon assimilation and oligotrophism. The methodology was applied in landfarming soil samples from Planalto Paulísta Refinery (REPLAN). Six isolates and control strains were submitted to experiments to verify the hypothesis done. Hydrophobicity was studied through quantification of oil-phase cell concentration after shaking the cell suspension with hydrocarbon. Hydrocarbon assimilation and oligotrophism were verified by analyzing the growth curves obtained with absorbance data. The results showed that landfarming soil has great potential for black yeast isolation, as 107 strains were recovered and a new species – Cladophialophora immunda- was revealed by molecular analyzes. Hydrophobicity test showed that cell hydrophobicity could not be the main selective factor, since hydrophobic and hydrophillic strains were recovered. Growth in media with hydrocarbons as sole carbon source was observed in the majority of the tested black yeast strains, indicating that hydrocarbon assimilation or tolerance to these substances could be the selective factors of the method. Exophiala xenobiotica was able to grow in the poor media tested, what suggests that this substrate with the addition of hydrocarbons could be used for the isolation...(Complete abstract, click electronic access below)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES

Aplicação do kDNA-PCR para diagnóstico de rotina de leishmaniose tegumentar americana em um hospital de referência

This study evaluated the applicability of kDNA-PCR as a prospective routine diagnosis method for American tegumentary leishmaniasis (ATL) in patients from the Instituto de Infectologia Emílio Ribas (IIER), a reference center for infectious diseases in São Paulo - SP, Brazil. The kDNA-PCR method detected Leishmania DNA in 87.5% (112/128) of the clinically suspected ATL patients, while the traditional methods demonstrated the following percentages of positivity: 62.8% (49/78) for the Montenegro skin test, 61.8% (47/76) for direct investigation, and 19.3% (22/114) for in vitro culture. The molecular method was able to confirm the disease in samples considered negative or inconclusive by traditional laboratory methods, contributing to the final clinical diagnosis and therapy of ATL in this hospital. Thus, we strongly recommend the inclusion of kDNA-PCR amplification as an alternative diagnostic method for ATL, suggesting a new algorithm routine to be followed to help the diagnosis and treatment of ATL in IIER.Este estudo avaliou a aplicabilidade do kDNA-PCR como método de rotina para diagnóstico de leishmaniose tegumentar americana (ATL) no Instituto de Infectologia Emílio Ribas (IIER), São Paulo, SP, Brasil. O método kDNA-PCR detectou DNA de Leishmania em 87,5% (112/128) dos pacientes com suspeita de ter leishmaniose e, os métodos tradicionais apresentaram as seguintes porcentagens de positividade: 62,8% (49/78) para o teste de Montenegro, 61,8% (47/76) para a pesquisa direta e 19,3% (22/114) para cultura in vitro. O método molecular confirmou a doença em amostras negativas ou inconclusivas pelos métodos laboratoriais tradicionais e, mostrou-se capaz de auxiliar na identificação de infecções causadas pela espécie Leishmania (V.) braziliensis. Além disso, a revisão dos prontuários médicos confirmou a importância do método PCR-RFLP no diagnóstico final de ATL, prognóstico e escolha do tratamento. Assim, recomendamos a inclusão do PCR como método diagnóstico de ATL na rotina hospitalar, e sugerimos um fluxograma para solicitação de exames laboratoriais.This study was supported by the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (Process No.: 2010/16963-4), the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), CNPq and the Laboratório de Investigação Médica 38 e 48 (LIM 38 and 48)

Aplicação do kDNA-PCR para diagnóstico de rotina de leishmaniose tegumentar americana em um hospital de referência

This study evaluated the applicability of kDNA-PCR as a prospective routine diagnosis method for American tegumentary leishmaniasis (ATL) in patients from the Instituto de Infectologia Emílio Ribas (IIER), a reference center for infectious diseases in São Paulo - SP, Brazil. The kDNA-PCR method detected Leishmania DNA in 87.5% (112/128) of the clinically suspected ATL patients, while the traditional methods demonstrated the following percentages of positivity: 62.8% (49/78) for the Montenegro skin test, 61.8% (47/76) for direct investigation, and 19.3% (22/114) for in vitro culture. The molecular method was able to confirm the disease in samples considered negative or inconclusive by traditional laboratory methods, contributing to the final clinical diagnosis and therapy of ATL in this hospital. Thus, we strongly recommend the inclusion of kDNA-PCR amplification as an alternative diagnostic method for ATL, suggesting a new algorithm routine to be followed to help the diagnosis and treatment of ATL in IIER.Este estudo avaliou a aplicabilidade do kDNA-PCR como método de rotina para diagnóstico de leishmaniose tegumentar americana (ATL) no Instituto de Infectologia Emílio Ribas (IIER), São Paulo, SP, Brasil. O método kDNA-PCR detectou DNA de Leishmania em 87,5% (112/128) dos pacientes com suspeita de ter leishmaniose e, os métodos tradicionais apresentaram as seguintes porcentagens de positividade: 62,8% (49/78) para o teste de Montenegro, 61,8% (47/76) para a pesquisa direta e 19,3% (22/114) para cultura in vitro. O método molecular confirmou a doença em amostras negativas ou inconclusivas pelos métodos laboratoriais tradicionais e, mostrou-se capaz de auxiliar na identificação de infecções causadas pela espécie Leishmania (V.) braziliensis. Além disso, a revisão dos prontuários médicos confirmou a importância do método PCR-RFLP no diagnóstico final de ATL, prognóstico e escolha do tratamento. Assim, recomendamos a inclusão do PCR como método diagnóstico de ATL na rotina hospitalar, e sugerimos um fluxograma para solicitação de exames laboratoriais.This study was supported by the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (Process No.: 2010/16963-4), the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), CNPq and the Laboratório de Investigação Médica 38 e 48 (LIM 38 and 48)