Искусственное оплодотворение у кукурузы и перспективы его использования

Summarizing article is devoted to the results and perspectives of artificial fertilization in vitro in maize. The methods of purification of male and female gametes, their fusion, production of endosperm and zygotes, which are able to produce the embryo, are described. The possibilities of the combination of the transgenic technique and the technique of the artificial fertilization are estimated.Узагальнено перспективи штучного запліднення in vitro у кукурудзи. Описано способи виділення чоловічих і жіночих гамет, одержання in vitro ендосперма та зигот, здатних формувати зародок. Розглядаються можливості поєднання трансгенної техніки та техніки штучного запліднення.Узагальнено перспективи штучного запліднення in vitro у кукурудзи. Описано способи виділення чоловічих і жіночих гамет, одержання in vitro ендосперма та зигот, здатних формувати зародок. Розглядаються можливості поєднання трансгенної техніки та техніки штучного запліднення

Динаміка розвитку зародка кукурудзи in vivo

The development dynamics and the structure of maize hybrid DK633/266´DK411 embryo in natural conditions were studied. The sequence of formation of basic embryo elements of the model hybrid according to its age could be used in biotechnological research for embryo isolation at a corresponding developmental stage. In the 14th day after pollination all the structural elements of embryo had been formed.Исследована динамика развития и строение зародыша у кукурузы в природных условиях на примере гибрида ДК633/266´ДК411. Установлена последовательность формирования основных элементов зародыша модельного гибрида в зависимости от его возраста, которая может быть использована в биотехнологических исследованиях для изоляции зародыша на соответствующей стадии развития. Определено, что на 14-е сутки после опыления сформированы все основные структурные элементы зародыша кукурузы.Досліджено динаміку розвитку та будову зародка у кукурудзи в природних умовах на прикладі гібриду ДК633/266´ДК411. Установлено, що послідовність формування основних елементів зародка модельного гібриду залежно від його віку може бути використана у біотехнологічних дослід­женнях для ізоляції зародка на відповідній стадії розвитку. Визначено, що на 14-ту добу після запилення сформовані всі основні структурні елементи зародка кукурудзи.

Formation of the female generative structures in Deutzia scarba (Hydrangeaceae)

Досліджено розвиток та будову сім’язачатку і зародкового мішка у представника родини Hydrangeaceae Deutzia scarba. Встановлено, що сім’язачаток даного виду € гемітропним, тенуінуцелятним, унітегмальним. Зародковий мішок розвивасться за Polygonum-типом. Будова зрілого сім’язачатку має специфічні особливості, пов’язані з розростанням мікропілярного кінця зародкового мішка.Досліджено розвиток та будову сім’язачатку і зародкового мішка у представника родини Hydrangeaceae Deutzia scarba. Встановлено, що сім’язачаток даного виду € гемітропним, тенуінуцелятним, унітегмальним. Зародковий мішок розвивасться за Polygonum-типом. Будова зрілого сім’язачатку має специфічні особливості, пов’язані з розростанням мікропілярного кінця зародкового мішка.The development and the structure of the ovule and the embryo sac of the representative of the family Hydrangeaceae Deutzia scarba are investigated. It is established that the ovule of the given species is hemitropic, tenuinucellatic, unitegmic. The embryo sac develops according to Polygonum-type. The structure of the mature ovule has the specific peculiarities connected with the growth of the mi- cropilar region of the embryo sac

Culture of isolated embryo sacs as a biotechnological system for the upgrowing of maize zygotic embryos in vitro

Установлено можливість дорозвинення зародка кукурудзи в культурі ізольованих зародкових мішків на штучному живильному середовищі в умовах in vitro від ранньої перехідної стадії до початку органогенезу. З’ясовано, що культивування зародкових мішків з метою дорощування зародка та накопичення крохмалю в ендоспермі повинно проводитися понад 20 діб. Забарвлення культивованого зародкового мішка може слугувати маркерною ознакою дорозвинення зародка та накопичення крохмалю в ендоспермі. Установлена возможность доразвития зародыша кукурузы в культуре изолированных зародышевых мешков на искусственной питательной среде в условиях in vitro от ранней переходной стадии до начала органогенеза. Выяснено, что культивирование зародышевых мешков с целью доращивания зародыша и накопления крахмала в эндосперме должно проводиться более 20 суток. Окрас­ка культивированного зародышевого мешка может служить маркерным признаком доразвития зародыша и накопления крахмала в эндосперме.Our research established the possibility of updevelopment of maize embryo in a culture of isolated embryo sacs in artificial nutrient medium in vitro from the transition stage up to the beginning of organogenesis. It was determined that the cultivation of embryo sacs for the purpose of an embryo upgrowing and starch accumulation in endosperm should continue more than 20 days. The colour of cultivated embryo sac can be considered as a marker of embryo’s upgrow and starch accumulation in endosperm

Study of abscisic acid as an inhibitor of the maize seedlings emergence and its use in biotechnology

Досліджено особливості росту та розвитку проростків кукурудзи під впливом абсцизової кислоти в діапазонах концентрацій 0,1–1,0, 10–100, 400 та 1000 мг/л. Показано, що інгібуюча дія навіть надвисоких концентрацій АБК зникає після припинення дії цього фактора. Цей підхід може бути застосований у біотехнологічних програмах тривалого зберігання селекційного матеріалу кукурудзи.Исследованы особенности роста и развития проростков кукурузы под влиянием абсцизовой кислоты в диапазонах концентраций 0,1-1,0, 10-100, 400 и 1000 мг / л. Показано, что ингибирующее действие даже сверхвысоких концентраций АБК исчезает после прекращения действия этого фактора. Этот подход может быть применен в биотехнологических программах длительного хранения селекционного материала кукурузы.The peculiarities of the growth and development of maize seedlings under the influence of abscisic acid (ABA) in the range of concentrations 0.1–1.0, 10–100, 400 and 1000 mg/l were studied. It was shown that inhibitory effect even under ultrahigh concentrations ofABAdisappeared after the breaking its influence off. The given approach can be applied to biotechnological programs on long-term preservation of breeding material of maize

Callusogenic potential of maize lines of Lancaster group in vitro

Оцінено лінії кукурудзи групи Ланкастер щодо реакції їх незрілих зародків на культивування in vitro. Здатність до калусогенезу зумовлена генотипом і залежить від наявності в родоводі лінії підплазми Oh43. Встановлено, що частота морфогенного калусогенезу для чутливих до культивування ліній групи Ланкастер складає 30–84 %. Визначено лінії, перспективні для використання у клітинній і генетичній інженерії кукурудзи за здатністю до утворення морфогенних калусів.Оценены линии кукурузы группы Ланкастер в отношении реакции их незрелых зародышей на культивирование in vitro. Способность к каллусогенезу обусловлена генотипом и зависит от наличия в родословной линии подплазмы Oh43. Установлено, что частота морфогенного каллусогенеза для чувствительных к культивированию линий группы Ланкастер находится на уровне 30–84 %. Выявлены линии, перспективные для использования в клеточной и генетической инженерии кукурузы по способности к образованию морфогенных каллусов.The estimation of maize inbred lines of theLancastergroup for immature embryos response to cultivation in vitro was made. It was noted that ability to callusogenesis was genotypically determined and depended on the presence of the subplasm Oh43 lineage. It was established that frequency of morphogenic callusogenesis in sensitive to cultivation Lancastergroup lines was at the level of 30–84 %. Promising maize inbreds cell and genetic engineering by an ability to produce morphogenic calli were identified

Influence of the long-term cold on isolated maize immature embryos in vitro

Вивчено вплив тривалої дії низької позитивної температури на ізольовані незрілі зародки різних генотипів кукурудзи при їх зберіганні в умовах in vitro. Показано можливість одержання життєздатних зелених проростків після тримісячного зберігання зародків на холоді. Порівнюється здатність до проростання за даних умов зародків ліній та гібридів F2. Розглядаються перспективи подальших досліджень для з’ясування умов ефективного зберігання ізольованих незрілих зародків і отримання з них життєздатних проростків.Вивчено вплив тривалої дії низької позитивної температури на ізольовані незрілі зародки різних генотипів кукурудзи при їх зберіганні в умовах in vitro. Показано можливість одержання життєздатних зелених проростків після тримісячного зберігання зародків на холоді. Порівнюється здатність до проростання за даних умов зародків ліній та гібридів F2. Розглядаються перспективи подальших досліджень для з’ясування умов ефективного зберігання ізольованих незрілих зародків і отримання з них життєздатних проростків.The influence of the long-term effect of low positive temperature on isolated immature embryos of different maize genotypes during their in vitro maintenance was studied. The possibility of obtaining vigorous green seedlings after 3-month cold storage of embryos was shown. The abilities of embryos of different lines and F2hybrids to germinate under the given conditions are compared. Perspectives of further investigations to ascertain the conditions of effective maintenance of isolated maize immature embryos and further obtaining vigorous seedlings are discussed

Регуляція морфогенезу in vitro у ліній кукурудзи групи Ланкастер

The aim of this work is the comparative evaluation of the influence of physiologically active substances (PAS) on the ratio of morphogenesis types in vitro and plant regeneration in callus tissues of maize inbreds of the Lancaster heterotic group. Lancaster inbreds of Ukrainian selection DК267, DК6080 and DК298 and lines PLS61, A188 and Chi31 of foreign selection which represented eponymous heterotic groups were selected for into the research. For callusogenesis induction immature embryos of 1.0–1.5 mm in length were planted on a modified N6 medium with 30 g/l sucrose. For regeneration the 30-day callus tissue was transplanted to a modified MS medium containing 20 g/l sucrose and various PAS: 6-benzylaminopurine (BAP) (0.1 mg/l) or indolylbutyric acid (IBA) (1.0 mg/l), or cefotaxime (CT) (150 mg/l). Morphogenesis and plant regeneration were obtained in callus tissue by organogenesis through the formation of leaf-like structures or shoots only without roots (hemmogenesis) and by embryogenesis through the development of embryos with the cooperative laying of the apexes of the shoot and the root. The predominant type of in vitro morphogenesis in both groups of genotypes was organogenesis. A tendency to increasing the embryogenesis level among Lancaster inbreds in comparison with the other investigated groups was observed. A certain tendency to increase the level of embryogenesis on a medium for regeneration with IBA, compared to other PAS, was marked. So, for the Lancaster group the embryogenesis level on the medium with IBA was 33.3%, while for the other investigated genotypes it was about 10.3%. Regeneration frequency was 45.8 plantlets/100 calli for Lancaster inbred DК298, 42.2 plantlets/100 calli for DК267 and 5.6 plantlets/100 calli for DК6080. Regeneration frequency of inbred PLS61 was 204.0 plantlets/100 calli, 100.0 plantlets/100 calli for Chi31 and 11.1 plantlets/100 calli for А188. Observed reductions in capacityfor plant regeneration of Lancaster inbreds may have been due to their pedigree. These inbreds belong to the commercial heterotic group that was not specially selected for increased regenerative ability, unlike the model inbreds of other heterotic groups. Overall, the level of regeneration frequency in the Lancaster group was 44.8 plantlets/100 calli on the medium under BAP, 41.4 plantlets/100 calli under IBA, and 20.7 plantlets/100 calli with CT. In general, the level of regeneration frequency for non-Lancaster heterotic groups reached 89.7 plantlets/100 calli on the medium with BAP, 96.7 plantlets/100 calli under IBA, and 93.1 plantlets/100 calli under CT. To enhance embryogenesis and frequency of regeneration for maize inbreds of the Lancaster group 30 g/l sucrose in the callusogenesis medium and physiologically active substance indolylbutyric acid (1.0 mg/l) in the medium for regeneration can be recommended.Охарактеризовано морфогенез in vitro на середовищі для регенерації у ліній кукурудзи гетерозисної групи Ланкастер порівняно з іншими гетерозисними групами – PLS61, А188 та Chi31 на базі 30-добової калусної тканини, отриманої з незрілих зародків, на фоні 30 г/л сахарози середовища для калусогенезу. Морфогенез in vitro у кукурудзи, який зумовлює отримання повноцінних фертильних рослин, відбувається двома шляхами: органогенезом і соматичним ембріогенезом (ембріоїдогенезом). Установлено генотиптипічний контроль за типом морфогенезу in vitro. Оцінено вплив фізіологічно активних речовин (6-бензиламінопурину, індолілмасляної кислоти та цефотаксиму) на співвідношення типів морфогенезу in vitro у ліній кукурудзи групи Ланкастер і неланкастерівських гетерозисних груп. Переважаючий тип морфогенезу in vitro – органогенез для всіх досліджених гетерозисних груп. Індолілмасляна кислота сприяє інтенсифікації процесу ембріоїдогенезу у разі застосування її як компонента регенераційного середовища як у ланкастерівських, так і неланкастерівських ліній. Відмічено значне переважання частоти регенерації у ліній PLS61, А188 та Chi31 над аналогічним показником для ліній групи Ланкастер. Охарактеризовано морфогенез in vitro на середовищі для регенерації у ліній кукурудзи гетерозисної групи Ланкастер порівняно з іншими гетерозисними групами – PLS61, А188 та Chi31 на базі 30-добової калусної тканини, отриманої з незрілих зародків, на фоні 30 г/л сахарози середовища для калусогенезу. Морфогенез in vitro у кукурудзи, який зумовлює отримання повноцінних фертильних рослин, відбувається двома шляхами: органогенезом і соматичним ембріогенезом (ембріоїдогенезом). Установлено генотиптипічний контроль за типом морфогенезу in vitro. Оцінено вплив фізіологічно активних речовин (6-бензиламінопурину, індолілмасляної кислоти та цефотаксиму) на співвідношення типів морфогенезу in vitro у ліній кукурудзи групи Ланкастер і неланкастерівських гетерозисних груп. Переважаючий тип морфогенезу in vitro – органогенез для всіх досліджених гетерозисних груп. Індолілмасляна кислота сприяє інтенсифікації процесу ембріоїдогенезу у разі застосування її як компонента регенераційного середовища як у ланкастерівських, так і неланкастерівських ліній. Відмічено значне переважання частоти регенерації у ліній PLS61, А188 та Chi31 над аналогічним показником для ліній групи Ланкастер.

Оптимізація мікроклонального розмноження in vitro материнки звичайної (Origanum vulgare)

Medicinal plants are important objects for botany, systematics and plant geography research, as well as physiology, pharmacology, and biotechnology. Medicinal plants from the Lamiaceae family are being intensively studied for medical and pharmacological reasons. This family also includes the medicinal herbaceous plant oregano (Origanum vulgare L.), known from ancient times for its antimicrobial and antifungal properties, the ability to strengthen the human immune system, and to improve the general state of an organism. At present, the study of its antimicrobial, antifungal, insecticidal, anticoagulant, antitumor, therapeutic and many other properties is being actively continued. Due to the relevance of the development of the principles of O. vulgare micropropagation in vitro and the undeveloped conditions and methods of its cultivation, the aim of this work was to optimize microclonation in vitro of oregano via the activation of auxiliary buds. The research tasks were to test the ability of auxiliary buds to be activated depending on the localization on the donor shoot internodes and to intensify the root formation of cuttings through medium content optimization. The influence of the location of the auxiliary buds on donor shoots on their activation in vitro was studied on such indicators as the length of newly formed shoots, the number of nodules per one newly formed shoot, and the number of newly formed shoots per one bud. In plant microclonal propagation, the stage of root formation is very important for further adaptation in soil. Practical experience has shown that for the effective adaptation of oregano in soil, the length of the root system for cuttings should be 1.5–2.0 cm, the degree of root system development – 4–5 points under shoot length of 3–5 cm. The study of peculiarities of oregano microclonal propagation via activation of auxiliary buds has allowed us to optimize the stage of explant selection for cutting and the formation of cuttings’ roots. It has been established that for optimal length, the number of nodules of the newly formed shoots and the number of newly formed shoots, the first internode, located on the top of a parent shoot, as well as the third to fifth ones are more suitable. For rooting oregano cuttings, the optimal medium on the ratio of length and density of root system and on shoot length is the nutrient one containing half of the macro-, microsalts and vitamins on Murashige-Skoog, 20 g/l sucrose and 0.75 mg/l kinetin.98   Лікарські рослини – важливі об'єкти ботаніки, систематики та географії, а також фізіології, фармакології та біотехнології. Лікарські рослини родини Lamiaceae інтенсивно вивчають у медичних і фармакологічних дослідженнях. До цієї родини відносять лікарську трав’янисту рослину материнку звичайну (Origanum vulgare L.), відому з давніх часів своїми антимікробними та протигрибковими властивостями, здатністю зміцнювати імунну систему людини та поліпшувати загальний стан організму. Нині активно вивчають її антимікробні, протигрибкові, інсектицидні, антикоагулянтні, протипухлинні, терапевтичні властивості та чимало інших. У зв’язку з актуальністю розроблення принципів клонування О. vulgare та нерозробленістю умов і способів її культивування in vitro мета дослідження полягала в оптимізації мікроклонального розмноження материнки через активацію пазушних бруньок. Досліджено вплив розташування пазушних бруньок на донорних пагонах на їх активацію in vitro за такими показниками як довжина новоутворених пагонів, кількість міжвузлів на новоутворений пагін, а також кількість новоутворених пагонів на бруньку. У мікроклональному розмноженні рослин стадія коренеутворення важлива для подальшої адаптації у ґрунті. Практичний досвід показав, що для ефективної адаптації материнки у ґрунті довжина кореневої системи живців повинна бути 1,5–2,0 см, ступінь розвитку кореневої системи – 4–5 балів за довжини пагона 3–5 см. Вивчення особливостей мікроклонального розмноження материнки через активацію пазушних бруньок дозволило оптимізувати етапи відбору експлантів для живцювання та утворення коренів у живців. Для оптимізації кількості новоутворених пагонів, їх довжини та кількості міжвузлів доцільне використання першого, розташованого на верхівці донорного пагона, а також третього–п’ятого міжвузлів. Для укорінення живців материнки оптимальне за співвідношенням довжини та щільності кореневої системи, довжини пагонів живильне середовище, яке містить половинну концентрацію мезо-, мікросолей і вітамінів заа Мурасіге – Скугом, 20 г/л сахарози та 0,75 мг/л кінетину

Оцінка здатності до прямої регенерації у ліній кукурудзи селекційної групи Ланкастер

In connection with the necessity of bringing elite maize inbreds of the Lancaster germplasm group, which have potential for cultivation in Ukraine, into the system of genetic tranformation, the aim of this investigation is to identify the ability of maize inbreds of this group to regenerate by direct organogenesis and to determine the optimal mineral basis for their nutritional environment using segments of the node area of shoots. As explantats we used sterile 4-day old seedlings of 4 maize inbreds of Lancaster germplasm and model inbred Chi31 exotic germplasm. The seedlings were obtained by germination of sterile seeds in Petri dishes between two layers of moist sterile filter paper at a temperature of 27 ºC in dark conditions. A single 1 cmlong segment was cut from each from each seedling, running from 0.5 cmbefore the node to 0.5 cmafter the node. A cut was made in each segment of the node in order to create a wounded surface. Explantats were planted in a nutrient environment with mineral bases of MS or N6, modified by the addition of 10 mg/l silver nitrate, 100 mg/l casein hydrolyzate, 690 mg/l L-proline, 30 g/l sucrose, 1.0 mg/l 2,4-dychlorphenoksiacetic acid and 0,1 mg/l abscisic acid. Cultivation was carried out at 25–27 ºC in the light. Direct hemogenesis in this environment on the 14th day of cultivation in vitro reached 100% for each line. This meant that all researched lines of Lancaster germplasm and the model line showed a high capacity for direct regeneration through direct hemogenesis, which does not depend on the composition of the mineral content of their nutritional environment. Callus formation was observed in all genotypes on the 14th day of cultivation in vitro and the extent of its formation increased during the following month of cultivation. The callus formation was observed only at the site of the wounded surface. The calluses were transparent. Although green areas appeared in these calluses, they were nonembryogenic and did not lead to regeneration. All explantats were transplanted into fresh nutrient media with simultaneous removal of germinated shoots on the 14th day of cultivation. Regeneration on the 45th day of cultivation took place by direct hemogenesis (formation of shoot or leafy structures) or direct hemoryzhogenesis (formation seedlings which had both shoot and root). Formation of ryzhogenic calli was observed in most inbreds. The frequency of regeneration of shoots and leaf structures was characterized by a tendency to increase indicators in the culture environment with mineral basis N6, and the frequency of regeneration of shoots was significantly marked using a medium with mineral basis MS. However, regeneration on the 45th day took place at a much lower rate than on the 14th day of cultivation, which must be taken into account when a system of genetic transformation systems using nodal segments of seedling shoots is being developed. Thus, using nodal sections of 4-day old seedling shoots of maize inbreds of Lancaster germplasm and model inbred Chi31, we can obtain viable seedlings for use in biological systems of agrobacterial transformation. We can recommend two variants of provoking regeneration by direct organogenesis in vitro for application in genetic transformation. The first variant suggests for all studied genotypes 100% induction on the 14th day of in vitro cultivation of direct organogenesis by hemogenesis and this requires further rooting of obtained shoots before planting into soil. Both variants of the nutrient environments of cultivation proposed us can be used. The second variant involves low frequency of regeneration by direct hemoryzhogenesis in a limited number of genotypes, but excludes the rooting stage. The cultivation environment with the mineral basis MS is recommended for this variant. The choice of either variant for obtaining direct regeneration depends on the particularity and aim of the research.Оцінено здатність до прямого органогенезу сегментів вузлової області пагонів 4-добових проростків ліній кукурудзи селекційної групи Ланкастер. Відзначено особливості прямої регенерації даних експлантатів. Регенерація на 14-у добу культивування сегментів вузлової області пагонів 4-добових проростків відбувається лише шляхом прямого гемогенезу, а на 45-у добу – шляхом прямого гемогенезу та прямого геморизогенезу. Відзначено вплив мінеральної основи живильного середовища на регенераційну здатність у культурі in vitro на 45-у добу культивування. Охарактеризовано сегменти вузлової області пагонів 5-добових проростків як експлантати для отримання ембріогенної калусної тканини та рослин-регенерантів. Відзначено зростання частоти утворення калусної тканини на поверхні вузлової області пагонів проростків при збільшенні тривалості культивування in vitro. Надано рекомендації щодо використання прямого гемогенезу та прямого геморизогенезу у біологічних системах агробактеріальної трансформації. Оцінено здатність до прямого органогенезу сегментів вузлової області пагонів 4-добових проростків ліній кукурудзи селекційної групи Ланкастер. Відзначено особливості прямої регенерації даних експлантатів. Регенерація на 14-у добу культивування сегментів вузлової області пагонів 4-добових проростків відбувається лише шляхом прямого гемогенезу, а на 45-у добу – шляхом прямого гемогенезу та прямого геморизогенезу. Відзначено вплив мінеральної основи живильного середовища на регенераційну здатність у культурі in vitro на 45-у добу культивування. Охарактеризовано сегменти вузлової області пагонів 5-добових проростків як експлантати для отримання ембріогенної калусної тканини та рослин-регенерантів. Відзначено зростання частоти утворення калусної тканини на поверхні вузлової області пагонів проростків при збільшенні тривалості культивування in vitro. Надано рекомендації щодо використання прямого гемогенезу та прямого геморизогенезу у біологічних системах агробактеріальної трансформації.