Clonage et caractérisation des uridine diphospho-glucuronosyltransferases (UGT) effectuant la glucuronidation des hormones stéroïdiennes chez la souris

La sous-famille Uridine diphosphoglucuronosyltransférases 2B (UGT2B) par son activité enzymatique de glucuronoconjugaison participe à l'élimination des stéroïdes. Les études in vitro faites sur les différentes UGT2B humains, notamment UGT2B15, et le génotypage de cette dernière sur différentes populations humaines ont permis de démontrer que cette enzyme pourrait jouer un rôle dans le cancer de la prostate. Représentant une cible thérapeutique potentielle, une compréhension plus exacte de son rôle physiologique ainsi que des études in vivo s'imposent. Actuellement aucun modèle animal n'existe pour faire l'étude in vivo de UGT2B 15. La souris, grâce au génie génétique, représente la meilleure avenue. Jusqu'à maintenant, aucune caractérisation enzymatique du métabolisme des hormones androgènes à partir des Ugt2b murin n'a été faite. Les présents travaux exposent la caractérisation enzymatique de cinq enzymes Ugt2b murins et tentent d'établir un parallèle entre elles et l'enzyme humain UGT2B 15, notamment entre leurs expressions tissulaires et leurs activités de conjugaisons des hormones androgènes. La perspective globale de ces travaux est de déterminer un orthologue sur lequel sera basé la création de souris déficientes

Le clonage et l'expression du cytochrome P450c17 humain dans le but d'étudier le rôle de la phosphorylation dans son activation

Le but de ce projet est d'étudier la phosphorylation sur le P450c17 humain. Un clone a donc été construit à partir de l'ARN extrait de glandes surrénales foetales et de cellules H295R. Une RT-PCR a été réalisée afin d'amplifier la séquence codante du P450c17, soit 1725 pb. Une fois l'ADNc humain cloné, séquencé et corrigé, son expression a été étudiée dans les cellules COS-1 (ces cellules ont été choisies car elles n'expriment pas le P450c17) à l'aide du vecteur pcDNA3.1/V5-His[indice supérieur Copyright]TOPO[indice supérieur Marque déposée]. Des tests d'optimisation de la transfection ont montré qu'une incubation de 24 heures avec comme réactif le fuGENE 6 (6 [micro]l) et 2 [micro]g d'ADN, était la meilleure condition pour obtenir le taux le plus élevé de transfection. Afin de savoir si le clone possédait l'activité 17[alpha]-hydroxylase et l'activité 17,20-lyase, des incubations avec divers substrats stéroïdiens et avec ou sans stimulation au 8-bromoadenosine 3 ' :5 ' -cyclic monophosphate furent réalisées. Une stimulation au 8-bromo permet d'apporter une phosphorylation de certains acides aminés qui sont nécessaires pour déclencher l'activité 17,20-lyase."--Résumé abrégé par UMI