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Análise de fluxos metabólicos com substrato isotopicamente marcado (13C-MFA) em S. typhimurium
Linhagens atenuadas de Salmonella têm sido estudadas para produção e veiculação de substâncias com fins terapêuticos. Modelos metabólicos à escala genômica são ferramentas importantes no desenvolvimento de estratégias de engenharia metabólica. Este trabalho teve por objetivo obter dados experimentais para aprimorar o modelo metabólico e aprofundar o conhecimento do metabolismo de S. typhimurium (St). Foram realizados cultivos contínuos à taxa de diluição (D) de 0,24 e 0,48 h-1, utilizando U-13C-glicose como substrato. Aminoácidos da biomassa foram analisados por GC-MS. A análise de fluxos metabólicos permitiu determinar a distribuição de fluxos nas principais vias metabólicas de St. A glicólise foi a via majoritamente utilizada para catabolisar a glicose. As maiores diferenças nos fluxos estimados, para as duas D, verificaram-se nas vias anapleróticas. Sobrepondo os dados de fluxos intracelulares ao modelo metabólico será gerado um modelo mais preciso do metabolismo de S. typhimurium
Avaliação de meios de cultura para produção de células de Salmonella typhimurium: Evaluation of culture media for the production of salmonella Typhimurium cells
A bactéria Salmonella typhimurium tem sido estudada para o desenvolvimento de vacinas contra diferentes agentes patogênicos com resultados bastante promissores. No entanto, apesar do uso frequente de S. typhimurium nestas pesquisas, pouco se sabe sobre as condições ótimas para o cultivo destas células em regime de alta densidade, o que é necessário para viabilizar a produção destas vacinas em larga escala. Neste trabalho foi feito o estudo da cinética de crescimento de S. typhimuium em 12 formulações de meio de cultivo, com o objetivo de encontrar a melhor composição que permitisse combinar alto acúmulo de biomassa e baixa produção de acetato. Foram realizados quatro conjuntos de experimentos, em duplicata, combinando três fontes de carbono (glicose, glicerol e xilose) com quatro fontes de nitrogênio complexas (triptona, extrato de levedura, soytone e phytone). Os cultivos foram realizados em frascos agitados a 250 rpm e 37C, e as amostras coletadas foram analisadas por turbidimetria e HPLC. Entre as fontes de carbono, a glicose permitiu atingir os maiores valores de µmax, porém levou à formação de concentrações inibitórias de acetato. As fontes de nitrogênio de origem vegetal (soytone e phytone) combinadas com xilose ou glicerol favoreceram um crescimento balanceado das células, com menor acúmulo de acetato e maior formação de biomassa. Em comparação com a condição controle (glicose + triptona), a formulação contendo o phytone combinado ao glicerol apresentou os melhores resultados, com um ganho de 40 % na produção de biomassa e redução de 45 % no acúmulo de acetato
Metabolic profiling of secreted fermentative byproducts by Salmonella typhimurium
Salmonella typhimurium is a pathogenic bacterium that has been studied to be used as a platform for vaccine development as a live bacterial vector (LBV). It is closely related to other enterobacteria like E. coli, but presents some metabolic differences
regarding the efficiency of biomass and energy production. This work presents a
metabolic profile of the main byproducts excreted by S. typhimurium aiming to
evaluate the distribution of carbon between respiratory and fermentative pathways
for this bacterium. A genome scale metabolic model (GSMM) of S. typhimurium
was also used to simulate the phenotypic behavior of this bacterium under the
studied conditions and compare the experimental results to the model predictions.
Simulations were performed using the free software Optflux and biomass
maximization was used as the objective function for Flux Balance Analysis (FBA).
Experimental cultivations were conducted in 2 L bioreactors with a working volume
of 0.8 L under varying dilution rates (D) of 0.1, 0.24, 0.5, 0.58 and 0.67 h-1, using 10.0
g/L of glucose as the sole carbon source and M9 minimum medium. The dissolved
oxygen concentration was kept at 30 % of its saturation, and pH and temperature
were kept constant at 7.0 and 37°C, respectively. Supernatant samples were analyzed
by HPLC to measure glucose consumption rate and fermentative products formation.
Our initial results showed an intense production of organic acids by S. typhimurium,
mainly acetic acid, at increasing amounts for higher dilution rates, and starting
from the lower dilution rate studied. From D of 0.5 to D = 0.67 h-1 formate was
also produced, and the secretion rates of both by-products increased linearly with
the growth rate. These results may reflect some metabolic limitations of the species
under investigation concerning its respiratory capacity, as the fermentative pathways
seem to be active even under low growth rates and aerobic conditions, what is not
observed for E. coli. It is also noteworthy that a considerable fraction of the carbon
consumed is directed to the formation of these metabolites, compromising the
biomass formation. Simulation results employing the free software Optflux 3.0.7 and
the GSMM STM_v1.0 predicted some aspects of the fermentative behavior observed
in the experiments, but with low accuracy, indicating that the model employed (that
was constructed based on an E. coli model) does not reflect the differences between
the metabolism of these two closed related bacteria. Results from this work will be
incorporated in the model to increase its predictive capacity regarding the organic
acids formation by Salmonella cells