Multi-Scale Host-Aware Modeling for Analysis and Tuning of Synthetic Gene Circuits for Bioproduction

[ES] Esta Tesis ha sido dedicada al modelado multiescala considerando al anfitrión celular para el análisis y ajuste de circuitos genéticos sintéticos para bioproducción. Los objetivos principales fueron: 1. El desarrollo de un modelo que considere el anfitrión celular de tamaño reducido enfocado para simulación y análisis. 2. El desarrollo de herramientas de programación para el modelado y la simulación, orientada a la biología sintética. 3. La implementación de un modelo multiescala que considere las escalas relevantes para la bioproducción (biorreactor, célula y circuito sintético). 4. El análisis del controlador antitético considerando las interacciones célula-circuito, como ejemplo de aplicación de las herramientas desarrolladas. 5. El desarrollo y la validación experimental de leyes de control robusto para biorreactores continuos. El trabajo presentado en esta Tesis cubre las tres escalas del proceso de bioproducción. La primera escala es el biorreactor: esta escala considera la dinámica macroscópica del sustrato y la biomasa, y como estas dinámica se conecta con el estado interno de las células. La segunda escala es la célula anfitriona: esta escala considera la dinámica interna de la célula y la competencia por los recursos limitados compartidos para la expresión de proteínas. La tercera escala es el circuito genético sintético: esta escala considera la dinámica de expresión de los circuitos sintéticos exógenos y la carga que inducen en la célula anfitriona. Por último, como > escala, parte de la Tesis se ha dedicado a desarrollar herramientas de software para el modelado y la simulación. Este documento se divide en siete capítulos. El Capítulo 1 es una introducción general al trabajo de la Tesis y su justificación; también presenta un mapa visual de la Tesis y enumera las principales contribuciones. El Capítulo 2 muestra el desarrollo del modelo del anfitrión celular (los Capítulos 4 y 5 hacen uso de este modelo para sus simulaciones). El Capítulo 3 presenta OneModel: una herramienta de software desarrollada en la Tesis que facilita el modelado y la simulación en biología sintética, en particular, facilita el uso del modelo del anfitrión celular. El Capítulo 4 utiliza el modelo del anfitrión celular para montar el modelo multiescala que considera el biorreactor y analiza el título, la productividad y el rendimiento en la expresión de una proteína exógena. El Capítulo 5 analiza un circuito más complejo, el recientemente propuesto y muy citado controlador biomolecular antitético, utilizando el modelo del anfitrión celular. El Capítulo 6 muestra el diseño de estrategias de control no lineal que permiten controlar la concentración de biomasa en un biorreactor continuo de forma robusta. El Capítulo 7 resume y presenta las principales conclusiones de la Tesis. En el Apéndice A se muestra el desarrollo teórico del modelo del anfitrión celular. Esta Tesis destaca la importancia de estudiar la carga celular en los sistemas biológicos, ya que estos efectos son muy notables y generan interacciones entre circuitos aparentemente independientes. La Tesis proporciona herramientas para modelar, simular y diseñar circuitos genéticos sintéticos teniendo en cuenta estos efectos de carga y permite el desarrollo de modelos que conecten estos fenómenos en los circuitos genéticos sintéticos, que van desde la dinámica intracelular de la expresión génica hasta la dinámica macroscópica de la población de células dentro del biorreactor.[CA] Aquesta Tesi tracta del modelat multiescala considerant l'amfitrió ce\lgem ular per a l'anàlisi i ajust de circuits genètics sintètics per a bioproducció. Els objectius principals van ser: 1. El desenvolupament d'un model de grandària reduïda que considere l'amfitrió ce\lgem ular, enfocat al seu ús en simulació i anàlisi. 2. El desenvolupament d'eines de programari per al modelatge i la simulació, orientada a la biologia sintètica. 3. La implementació d'un model multiescala que considere les escales rellevants per a la bioproducció (bioreactor, cè\lgem ula i circuit sintètic). 4. L'anàlisi del controlador antitètic considerant les interacciones cè\lgem ula-circuit, com a exemple d'aplicació de les eines desenvolupades. 5. El desenvolupament i la validació experimental de lleis de control robust per a bioreactors continus. El treball presentat en aquesta Tesi cobreix les tres escales del procés de bioproducció. La primera escala és el bioreactor: aquesta escala considera la dinàmica macroscòpica del substrat i la biomassa, i com aquestes dinàmiques es connecten amb l'estat intern de les cè\lgem ules. La segona escala és la cè\lgem ula amfitriona: aquesta escala considera la dinàmica interna de la cè\lgem ula i la competència pels recursos limitats compartits per a l'expressió de proteïnes. La tercera escala és la del circuit genètic sintètic: aquesta escala considera la dinàmica d'expressió de circuits sintètics exógens i la càrrega que indueixen en la cè\lgem ula amfitriona. Finalment, com a > escala, part de la Tesi s'ha dedicat a desenvolupar eines de programari per al modelatge i la simulació. Aquest document es divideix en set capítols. El Capítol 1 és una introducció general al treball de la Tesi i la seua justificació; també presenta un mapa visual de la Tesi i enumera les principals contribucions. El Capítol 2 mostra el desenvolupament del model de l'amfitrió ce\lgem ular (els Capítols 4 i 5 fan ús d'aquest model per a les seues simulacions). El Capítol 3 presenta OneModel: una eina de programari desenvolupada en la Tesi que facilita el modelatge i la simulació en biologia sintètica, en particular, facilita l'ús del model de l'amfitrió ce\lgem ular. El Capítol 4 utilitza el model de l'amfitrió ce\lgem ular per a muntar el model multiescala que considera el bioreactor i analitza el títol, la productivitat i el rendiment en l'expressió d'una proteïna exògena. El Capítol 5 analitza un circuit més complex, el recentment proposat i molt citat controlador biomolecular antitètic, utilitzant el model de l'amfitrió ce\lgem ular. El Capítol 6 mostra el disseny d'estratègies de control no lineal que permeten controlar la concentració de biomassa en un bioreactor continu de manera robusta. El Capítol 7 resumeix i presenta les principals conclusions de la Tesi. En l'Apèndix A es mostra el desenvolupament teòric del model de l'amfitrió ce\lgem ular. Aquesta Tesi destaca la importància d'estudiar la càrrega ce\lgem ular en els sistemes biològics, ja que aquests efectes són molt notables i generen interaccions entre circuits aparentment independents. La Tesi proporciona eines per a modelar, simular i dissenyar circuits genètics sintètics tenint en compte aquests efectes de càrrega i permet el desenvolupament de models que connecten aquests fenòmens en els circuits genètics sintètics, que van des de la dinàmica intrace\lgem ular de l'expressió gènica fins a la dinàmica macroscòpica de la població de cè\lgem ules dins del bioreactor.[EN] This Thesis was devoted to the multi-scale host-aware analysis and tuning of synthetic gene circuits for bioproduction. The main objectives were: 1. The development of a reduced-size host-aware model for simulation and analysis purposes. 2. The development of a software toolbox for modeling and simulation, oriented to synthetic biology. 3. The implementation of a multi-scale model that considers the scales relevant to bioproduction (bioreactor, cell, and synthetic circuit). 4. The host-aware analysis of the antithetic controller, as an example of the application of the developed tools. 5. The development and experimental validation of robust control laws for continuous bioreactors. The work presented in this Thesis covers the three scales of the bioproduction process. The first scale is the bioreactor: this scale considers the macroscopic substrate and biomass dynamics and how these dynamics connect to the internal state of the cells. The second scale is the host cell: this scale considers the internal dynamics of the cell and the competition for limited shared resources for protein expression. The third scale is the synthetic genetic circuit: this scale considers the dynamics of expressing exogenous synthetic circuits and the burden they induce on the host cell. Finally, as a > scale, part of the Thesis was devoted to developing software tools for modeling and simulation. This document is divided into seven chapters. Chapter 1 is an overall introduction to the Thesis work and its justification; it also presents a visual map of the Thesis and lists the main contributions. Chapter 2 shows the development of the host-aware model (Chapters 4 and 5 make use of this model for their simulations). Chapter 3 presents OneModel: a software tool developed in the Thesis that facilitates modeling and simulation for synthetic biology---in particular, it facilitates the use of the host-aware model---. Chapter 4 uses the host-aware model to assemble the multi-scale model considering the bioreactor and analyzes the titer, productivity (rate), and yield in expressing an exogenous protein. Chapter 5 analyzes a more complex circuit, the recently proposed and highly cited antithetic biomolecular controller, using the host-aware model. Chapter 6 shows the design of nonlinear control strategies that allow controlling the concentration of biomass in a continuous bioreactor in a robust way. Chapter 7 summarizes and presents the main conclusions of the Thesis. Appendix A shows the theoretical development of the host-aware model. This Thesis emphasizes the importance of studying cell burden in biological systems since these effects are very noticeable and generate interactions between seemingly unconnected circuits. The Thesis provides tools to model, simulate and design synthetic genetic circuits taking into account these burden effects and allowing the development of models that connect phenomena in synthetic genetic circuits, ranging from the intracelullar dynamics of gene expression to the macroscopic dynamics of the population of cells inside the bioreactor.This research was funded by MCIN/AEI/10.13039/501100011033 grant number PID2020-117271RB-C21, and MINECO/AEI, EU grant number DPI2017-82896- C2-1-R. The author was recipient of the grant “Programa para la Formación de Personal Investigador (FPI) de la Universitat Politècnica de València — Subprograma 1 (PAID-01-2017)”. The author was also a grantee of the predoctoral stay “Ayudas para Movilidad de Estudiantes de Doctorado de la Universitat Politècnica de València 2019”. The Control Theory and Systems Biology Lab of the ETH Zürich is acknowledged for accepting the author in their facilities as predoctoral stay and their valuable collaboration sharing knowledge.Santos Navarro, FN. (2022). Multi-Scale Host-Aware Modeling for Analysis and Tuning of Synthetic Gene Circuits for Bioproduction [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183473Premios Extraordinarios de tesis doctorale

Control de la concentración de microorganismos en mini-turbidostatos

[ES] A efectos de maximizar el rendimiento y productividad de los bioprocesos, la biotecnología industrial actual ha de hacer frente a problemas críticos, como son el modelado, la estimación de variables clave, y el diseño de mecanismos de actuación (control) sobre el estado metabólico de los microorganismos. En los últimos años, los turbidostatos de pequeña escala, que usan un circuito de realimentación para mantener constante la densidad celular, están empezando a estar disponibles en los laboratorios para realizar caracterización y escalado de sistemas biológicos sin restricciones de nutrientes. De esta forma, los turbidostatos son una herramienta prometedora para ser utilizada como paso intermedio entre el laboratorio y el biorreactor industrial. En el presente proyecto se ha diseñado e implementado un turbidostato, centrándose el proyecto en los aspectos de medida de concentración de biomasa, estimación de la tasa específica de crecimiento, y uso de ambos para el control en bucle cerrado de la concentración de biomasa. Además, se han conseguido realizar experimentos físicos probando su funcionamiento. La tarea de construir un turbidostato es un proceso complejo que combina muchas ramas del conocimiento: biología, electrónica, teoría de control y óptica. En primer lugar, se ha diseñado e implementado un sensor óptico de concentración de biomasa basado en medida de absorbancia. Este sensor óptico está compuesto por un módulo laser y dos fotodiodos colocados estratégicamente para poder medir la pérdida de intensidad del haz láser al atravesar el cultivo. En segundo lugar, se ha tratado el problema de control en bucle cerrado de la concentración de biomasa a partir de medidas de la misma. Cabe destacar que el modelo matemático de un turbidostato es no-lineal y existen parámetros que no se pueden determinar. El control adaptativo no lineal implementado utiliza un modelo mínimo del proceso, pero, por contra, requiere la medida de la tasa específica de crecimiento del microorganismo. Esta señal no puede medirse directamente, por lo que se ha implementado un observador para su estimación. Se ha utilizado un observador discreto deslizante de segundo orden, que asegura convergencia de las estimaciones en tiempo finito, al mismo tiempo que estimaciones suaves. Por otro lado, se ha desarrollado un programa en Matlab que permite la monitorización y control del estado del turbidostato. También se ha añadido un simulador para facilitar las tareas de diseño del controlador.Santos Navarro, FN. (2016). Control de la concentración de microorganismos en mini-turbidostatos. Universitat Politècnica de València. http://hdl.handle.net/10251/75865TFG

Diseño y control de miniturbidostatos

[CA] A efectos de maximizar el rendimiento y productividad de los bioprocesos, la biotecnología industrial actual ha de hacer frente a problemas críticos, como son el modelado, la estimación de variables clave, y el diseño de mecanismos de actuación (control) sobre el estado metabólico de los microorganismos. En los últimos años, los turbidostatos de pequeña escala, que usan un circuito de realimentación para mantener constante la densidad celular, están empezando a estar disponibles en los laboratorios para realizar caracterización y escalado de sistemas biológicos sin restricciones de nutrientes. De esta forma, los turbidostatos son una herramienta prometedora para ser utilizada como paso intermedio entre el laboratorio y el biorreactor industrial. En el presente proyecto se ha diseñado e implementado un turbidostato, a partir de un diseño e implementación parcial proporcionada por el ai2. Se ha revisado, mejorado y ampliado el diseño proporcionado por el ai2 para satisfacer las nuevas necesidades: modo autónomo, mayor capacidad de cálculo, ampliación a cinco cámaras de cultivo en paralelo. Se ha realizado un diseño nuevo de la estructura del turbidostato, el cual consiste en un módulo de control y un módulo para las cámaras de cultivo. Por otro lado, se ha hecho una revisión del sensor de biomasa, mejorando su precisión y resolución, al utilizar un módulo específico de la BeagleBone Black para tratar la señal de frecuencia generada. El observador ha sido optimizado para reducir el ruido en su estimación y además se han desarrollado estratégicas para acelerar en gran medida su convergencia. Se han implementado y diseñado varios tipos de control, destacando el controlador no-lineal adaptativo desarrollado por el ai2. Se ha desarrollado una aplicación en C/C++ que se ejecutará en la BeagleBone Black del turbidostato, esta se encargará de realizar el control y además ejecutará un servidor TCP para poder comunicarse con la aplicación desde el exterior. Por tanto, ha sido necesario elaborar un protocolo de comunicación. Se ha desarrollado una aplicación en Java, la cual podrá ser ejecutada en un ordenador personal. Servirá de interfaz gráfica con el turbidostato, desde la cual se podrá variar todos los parámetros de control y recopilar los datos experimentales. La aplicación está basada en un cliente TCP. Además se ha construido un prototipo de una única cámara de cultivo para realizar la validación experimental del sistema. Una vez validado la funcionalidad del prototipo, se ha realizado varias pruebas experimentales utilizando diferentes tipos de control. Los resultados obtenidos fueron exitosos y fueron utilizados para realizar una publicación científica en la prestigiosa revista “IEEE TRANSACTIONS ON CONTROL SYSTEMS TECHNOLOGY”.Santos Navarro, FN. (2017). Diseño y control de miniturbidostatos. http://hdl.handle.net/10251/94047TFG

Gene Expression Space Shapes the Bioprocess Trade-Offs among Titer, Yield and Productivity

[EN] Optimal gene expression is central for the development of both bacterial expression systems for heterologous protein production, and microbial cell factories for industrial metabolite production. Our goal is to fulfill industry-level overproduction demands optimally, as measured by the following key performance metrics: titer, productivity rate, and yield (TRY). Here we use a multiscale model incorporating the dynamics of (i) the cell population in the bioreactor, (ii) the substrate uptake and (iii) the interaction between the cell host and expression of the protein of interest. Our model predicts cell growth rate and cell mass distribution between enzymes of interest and host enzymes as a function of substrate uptake and the following main lab-accessible gene expression-related characteristics: promoter strength, gene copy number and ribosome binding site strength. We evaluated the differential roles of gene transcription and translation in shaping TRY trade-offs for a wide range of expression levels and the sensitivity of the TRY space to variations in substrate availability. Our results show that, at low expression levels, gene transcription mainly defined TRY, and gene translation had a limited effect; whereas, at high expression levels, TRY depended on the product of both, in agreement with experiments in the literature.This research was partially supported by grants MINECO/AEI, EU DPI2017-82896-C21-R 662 and MICINN/AEI, EU PID2020-117271RB-C21. F.N.S.-N. thanks the UPV grant number PAID-01-2017.Santos-Navarro, FN.; Boada-Acosta, YF.; Vignoni, A.; Picó, J. (2021). Gene Expression Space Shapes the Bioprocess Trade-Offs among Titer, Yield and Productivity. Applied Sciences. 11(13):1-17. https://doi.org/10.3390/app11135859S117111

Output Feedback Linearization of Turbidostats After Time Scaling

"© 2019 IEEE. Personal use of this material is permitted. Permissíon from IEEE must be obtained for all other uses, in any current or future media, including reprinting/republishing this material for advertisíng or promotional purposes, creating new collective works, for resale or redistribution to servers or lists, or reuse of any copyrighted component of this work in other works."[EN] Turbidostats are a class of bioreactors gaining interest due to the recent availability of microscale and small-scale devices for characterization and scalingup of the biotechnological systems relevant in the biotech and pharma industries. The goal is to keep cell density constant in continuous operation. Thus, the control law, i.e., the substrate feeding strategy, must guarantee global or semiglobal convergence to an equilibrium point. However, their control is difficult due to the uncertain, time varying, and nonlinear nature of the processes involved. In this brief, we propose an adaptive control law that globally stabilizes the desired biomass setpoint. Furthermore, in a certain region of the state space, the controller linearizes the dynamic behavior after some time scaling. By this way, the orbits of the closedloop system are imposed by the designer. The intrinsic integral action of the gain adaptation rejects the parameter uncertainties. Moreover, the controller implementation only assumes the biomass concentration to be measured. Both the simulated and experimental results show the performance of the controller.This work was supported in part by the National University of La Plata under Grant 11-I127, in part by ANPCyT under Grant PICT2014 2394, in part by CONICET under Grant PIP112 2015 0837, and in part by MINECO/AEI/FEDER, UE under Grant DPI2014-55276-C5-1-R and Grant DPI2017-82896-C2-1-R. The work of F. N. Santos-Navarro was supported by ai2-UPV.De Battista, H.; Picó-Marco, E.; Santos-Navarro, FN.; Picó, J. (2019). Output Feedback Linearization of Turbidostats After Time Scaling. IEEE Transactions on Control Systems Technology. 27(4):1668-1676. https://doi.org/10.1109/TCST.2018.2834882S1668167627

RBS and Promoter Strengths Determine the Cell-Growth-Dependent Protein Mass Fractions and Their Optimal Synthesis Rates

[EN] Models of gene expression considering host-circuit interactions are relevant for understanding both the strategies and associated trade-offs that cell endogenous genes have evolved and for the efficient design of heterologous protein expression systems and synthetic genetic circuits. Here, we consider a small-size model of gene expression dynamics in bacterial cells accounting for host-circuit interactions due to limited cellular resources. We define the cellular resources recruitment strength as a key functional coefficient that explains the distribution of resources among the host and the genes of interest and the relationship between the usage of resources and cell growth. This functional coefficient explicitly takes into account lab-accessible gene expression characteristics, such as promoter and ribosome binding site (RBS) strengths, capturing their interplay with the growth-dependent flux of available free cell resources. Despite its simplicity, the model captures the differential role of promoter and RBS strengths in the distribution of protein mass fractions as a function of growth rate and the optimal protein synthesis rate with remarkable fit to the experimental data from the literature for Escherichia coli. This allows us to explain why endogenous genes have evolved different strategies in the expression space and also makes the model suitable for model-based design of exogenous synthetic gene expression systems with desired characteristics.This work was partially supported by grants MINECO/AEI, EU DPI2017-82896-C2-1-R, and MCIN/AEI/10.13039/501100011033 grant number PID2020-117271RB-C21. F.N.S.-N. is grateful to grant PAID-01-2017 (Universitat Politecnica de Valencia). The authors are very grateful to the anonymous reviewers for their comprehensive and in-depth reviews.Santos-Navarro, FN.; Vignoni, A.; Boada-Acosta, YF.; Picó, J. (2021). RBS and Promoter Strengths Determine the Cell-Growth-Dependent Protein Mass Fractions and Their Optimal Synthesis Rates. ACS Synthetic Biology. 10(12):3290-3303. https://doi.org/10.1021/acssynbio.1c0013132903303101

Modeling and Optimization of a Molecular Biocontroller for the Regulation of Complex Metabolic Pathways

[EN] Achieving optimal production in microbial cell factories, robustness against changing intracellular and environmental perturbations requires the dynamic feedback regulation of the pathway of interest. Here, we consider a merging metabolic pathway motif, which appears in a wide range of metabolic engineering applications, including the production of phenylpropanoids among others. We present an approach to use a realistic model that accounts for in vivo implementation and then propose a methodology based on multiobjective optimization for the optimal tuning of the gene circuit parts composing the biomolecular controller and biosensor devices for a dynamic regulation strategy. We show how this approach can deal with the trade-offs between the performance of the regulated pathway, robustness to perturbations, and stability of the feedback loop. Using realistic models, our results suggest that the strategies for fine-tuning the trade-offs among performance, robustness, and stability in dynamic pathway regulation are complex. It is not always possible to infer them by simple inspection. This renders the use of the multiobjective optimization methodology valuable and necessary.This research was funded by MCIN/AEI/10.13039/501100011033 grant number PID 2020-117271RB-C21. YB thanks to Universitat Politècnica de València (Grant PAID-10-21 Acceso al Sistema Español de Ciencia e Innovación), and Secretaría de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación-Ecuador (Scholarship Convocatoria Abierta 2011). FS-N is grateful to grant PAID-01-2017 from Universitat Politècnica de València.Boada-Acosta, YF.; Santos-Navarro, FN.; Picó, J.; Vignoni, A. (2022). Modeling and Optimization of a Molecular Biocontroller for the Regulation of Complex Metabolic Pathways. Frontiers in Molecular Biosciences. 9:1-14. https://doi.org/10.3389/fmolb.2022.801032114