pilot study

No processo de envelhecimento, a pele sofre alterações que resultam na redução de componentes essenciais, como o colagénio, elastina e ácido hialurónico. Essa diminuição contribui para as rugas, flacidez e perda de volume facial, características comuns do envelhecimento cutâneo. O ácido hialurónico desempenha um papel fundamental na hidratação, elasticidade e aparência jovial da pele. Na dermatologia estética, o ácido hialurónico é frequentemente utilizado como um preenchedor dérmico para restaurar a hidratação e volume facial perdido. No entanto, complicações podem ocorrer, desde resultados insatisfatórios, reações inflamatórias e infeções, formação de nódulos a obstrução vascular e necrose, ainda que raras. A hialuronidase é uma enzima importante no tratamento dessas complicações, dissolvendo o ácido hialurónico indesejado e revertendo os efeitos adversos. A hialuronidase pode ser classificada em três tipos de acordo com seu mecanismo de ação: mamífera, de sanguessuga/ancilostomídeo e microbiana. As duas primeiras atuam por quebra das ligações glicosídicas no ácido hialurónico e noutros componentes, enquanto a hialuronidase microbiana atua por eliminação, resultando em dissacarídeos insaturados. As formulações de hialuronidase podem ser obtidas de fontes bovina, ovina ou bacteriana. Atualmente existe uma hialuronidase recombinante humana, que é considerada a mais segura e menos imunogénica. No tratamento de complicações relacionadas com o preenchimento com ácido hialurónico, a hialuronidase pode ser usada tanto em situações de emergência, das quais se incluem as complicações vasculares, como em situações eletivas, para corrigir resultados indesejados. As doses de hialuronidase variam dependendo da situação, mas geralmente são administradas entre 3 a 75 unidades internacionais, sendo recomendado avaliar os resultados após 48 horas e repetir o tratamento conforme necessário. É importante massajar a área após a aplicação da hialuronidase e aguardar pelo menos 3 horas antes de reaplicar o ácido hialurónico. Apesar de muitos estudos já terem descrito a eficácia dos produtos de hialuronidase na resolução dos efeitos indesejáveis dos preenchedores de ácido hialurónico, pouca atenção tem sido dada à sua segurança. Alguns estudos avaliaram essa questão especificamente quanto à hialuronidase recombinante humana, embora não exatamente na pele. Mas poucos se focaram em estudar o mesmo para as hialuronidases de origem animal, que ainda são as formulações mais comercializadas. Por esta razão, uma análise histológica dos efeitos de uma hialuronidase bovina do mercado é realizada no presente estudo. Esta foi realizada em tecido cutâneo após a morte num porco, uma vez que este modelo é amplamente reconhecido como uma boa representação da pele humana pelas inúmeras semelhanças, e não ocorrerem alterações significativas na derme nas primeiras 18 horas após a morte, quando mantida a 37º C. O ácido hialurónico intrínseco foi observado através da coloração Azul alciano, que tem sido amplamente utilizada para evidenciá-lo. O objetivo deste estudo piloto é avaliar os efeitos da aplicação de duas doses de hialuronidase no ácido hialurónico intrínseco dérmico, ao longo do tempo. Um estudo experimental ex-vivo foi conduzido na Faculdade de Medicina Dentária da Universidade de Lisboa para avaliar os efeitos de diferentes doses de uma hialuronidase bovina injetada nos níveis de ácido hialurónico endógeno na pele de porcos ao longo de um período de 6 horas. O desenho do estudo consistiu em quatro grupos diferentes: injeção de duas doses diferentes de hialuronidase: 18,75 UI (grupo A) e 37,5 UI (grupo B), um grupo de controlo negativo sem injeções (C) e injeção de solução salina como controlo positivo (D), para comparação. Cada grupo contém 2 tempos de biópsia diferentes: 1 hora (A1, B1, C1 e D1) e 6 horas (A2, B2, C2 e D2) após a injeção, exceto o controlo negativo que apresenta uma biópsia adicional ao momento inicial (C0). Para obtenção das amostras de pele, porcos de um matadouro local foram sacrificados e foram coletadas amostras de pele simétricas com medidas de 5,5 x 10,5 cm cada, imediatamente após a morte. As amostras foram colocadas em recipientes com DMEM de forma a manter a viabilidade do tecido. Antes das injeções, foram realizados na pele pontos de sutura de forma a marcar os locais de injeção e posteriormente da biópsia. As injeções foram realizadas usando hialuronidase BCN, disponível no mercado e solução salina. Duas concentrações diferentes de hialuronidase (375 UI/mL e 187,5 UI/mL) foram preparadas diluindo um frasco de 1500 UI em solução salina. Um Médico Dentista calibrado e com experiência em harmonização facial realizou todas as injeções, garantindo a adequada desinfecção da pele antes de cada injeção e massajando após. As injeções foram administradas perpendicularmente à pele, na derme, usando uma agulha 28G e seringa de 1 mL. Após as injeções, biópsias de pele foram feitas no momento inicial, após 1 hora e após 6 horas usando um bisturi circular de 4,5 mm de diâmetro. As amostras foram imediatamente fixadas em formaldeído a 4% e enviadas para análise histológica. O processamento histológico das amostras foi realizado por uma estudante sob supervisão de uma especialista em anatomia patológica da Faculdade de Medicina Dentária. As amostras foram submetidas a fixação, desidratação, diafanização, incorporação em parafina e seccionamento usando um micrótomo. As seções resultantes foram então submetidas a coloração com Hematoxilina e Eosina e coloração com Azul alciano. A coloração H&E foi realizada para avaliar a morfometria, enquanto a coloração com Azul alciano foi utilizada para destacar o ácido hialurónico. As lâminas coradas foram examinadas usando um microscópio ótico e analisadas por um estudante com a ajuda do especialista. Após a injeção, não foram observadas diferenças macroscópicas. Histologicamente, foi observada preservação da arquitetura tecidual no momento inicial e em todas os grupos após 1 hora, com observação da integridade da epiderme com distribuição adequada das suas camadas, organização normal da derme, presença de estruturas anexas intactas e tecido subcutâneo com estrutura preservada. Infiltrados inflamatórios foram observados em todas as amostras histológicas examinadas, com intensidade e distribuição semelhantes. A intensidade da coloração de Azul alciano, usada para visualizar o ácido hialurónico, foi semelhante em todas as amostras analisadas, tanto no momento inicial quanto após 1 hora da injeção de diferentes concentrações de hialuronidase, solução salina (controlo positivo) e ausência de tratamento (controlo negativo). O tecido conjuntivo foi corado de forma homogénea, mostrando uma coloração azul clara, e os núcleos celulares apareceram corados de vermelho. Os resultados deste estudo não mostraram diferenças na quantidade ou distribuição do ácido hialurónico entre o momento inicial e 1 hora após a aplicação da hialuronidase em concentrações até 37,5 UI. Esses resultados divergem de estudos anteriores que observaram uma redução dos níveis de ácido hialurónico com concentrações mais baixas que as utilizadas neste estudo. Isto pode ser atribuído a uma diminuída sensibilidade da técnica que pode não detetar variações subtis nos níveis de ácido hialurónico tecidular. Podemos encontrar algumas limitações neste estudo, como o recurso a um modelo ex vivo, que implica ausência de circulação sistémica e afeta consequentemente fatores importantes, nomeadamente a clearence da hialuronidase, e a utilização de um método de avaliação qualitativo e inespecífico para o ácido hialurónico. Ainda assim, a similaridade da pele entre o humano e o porco permitiu prever de forma fidedigna as alterações morfológicas e celulares. A ausência de alterações histológicas observadas pela uniformidade da coloração do Azul alciano indica o potencial promissor de doses injetáveis de hialuronidase entre 18,75 UI e 37,5 UI como intervenção segura, para o tempo analisado. Este estudo piloto mostra a adequação do modelo suíno e a eficácia da metodologia nele empregada, servindo como um ponto de partida para futuras investigações histológicas.Aim: The aim of this pilot study is to evaluate the effects of the application of two hyaluronidase doses on dermal intrinsic hyaluronic acid, over time. Methods: Fresh skin pig’s nose were collected from a local slaughterhouse. Two study groups were evaluated after intradermal injection of 0,1 ml of 18,75 IU of HYAL (group A) and 37,5 IU of HYAL (group B). For comparative purposes, two control groups were employed: a group without injections as the negative control (group C), to assess possible postmortem changes, and a group subjected to 0,1 mL of saline solution injection as the positive control (group D). Skin biopsies were performed 1 hour and 6 hours after injections. An additional biopsy was performed at baseline without any injection. The samples were histologically processed and later submitted to Hematoxylin and Eosin and Alcian blue staining, for the study of morphometry and evidence of hyaluronic acid, respectively. Results: Upon histological examination, the tissue architecture was found to be well-preserved in the initial control group, evidenced by the integrity of the epidermis, normal organization of dermis and conserved structure of subcutaneous layer. At 1 hour, the skin samples of the different groups also demonstrated preservation of tissue architecture. The intensity and distribution of Alcian blue staining was similar in all analyzed samples. The connective tissue was homogeneously stained, showing a light blue color. Conclusion: The absence of observed histological changes through the uniformity of Alcian blue staining indicates the promising potential of injectable doses hyaluronidase between 18,75 IU and 37,5 IU as a safe intervention, for the time analyzed. This pilot study shows the suitability of the porcine model and the effectiveness of the methodology employed on it so it serves as a valuable starting point for future histological investigations