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Evaluaci贸n de la participaci贸n de RabGDI1 de Solanum chilense en el tr谩fico vesicular y en la tolerancia al estr茅s salino en Arabidopsis thaliana
101 p.Bajo situaciones de estr茅s las plantas desarrollan estrategias que le permiten incrementar sus niveles basales de tolerancia. Algunas de las estrategias identificadas contemplan la activaci贸n de genes implicados en las v铆as de tr谩fico vesicular, este argumento encuentra sustento en investigaciones que demuestran un aumento en las din谩micas endoc铆ticas cuando las plantas se someten a estr茅s salino. Adicionalmente se ha comprobado que la expresi贸n constitutiva de algunos genes del tr谩fico vesicular en plantas modelo mostraron resultados satisfactorios en el incremento de la tolerancia a la salinidad. Investigaciones preliminares en la especie de tomate silvestre Solanum chilense (Dunal) Reiche, tolerante a la salinidad, han permitido la identificaci贸n de un transcrito que es inducido en respuesta al estr茅s salino. An谩lisis inform谩ticos revelaron que la secuencia nucleot铆dica de este transcrito pose铆a un alto grado de identidad con el gen que codifica para la prote铆na del inhibidor de la disociaci贸n de GDP (GDI), del tipo Rab-GDI y debido a su homolog铆a con el gen de Arabidopsis (AtGDI1), se denomin贸 Solanum chilense RabGDI1 (SchRabGDI1). La funcionalidad de esta prote铆na se relaciona con los procesos de tr谩fico vesicular, permitiendo la extracci贸n de las RabGTPasas desde la membrana de destino y luego manteni茅ndolas solubles en el citoplasma, como una reserva, para un pr贸ximo movimiento de ves铆culas. Para desarrollar esta investigaci贸n se propusieron los siguientes objetivos; (1) determinar el perfil transcripcional 贸rgano espec铆fico de SchRabGDI1 y durante el estr茅s salino, (2) identificar las caracter铆sticas estructurales y filogen茅ticas de la prote铆na codificada por SchRabGDI1. (3) determinaci贸n de la identidad funcional del producto g茅nico de SchRabGDI1. (4) determinar la capacidad de interacci贸n de SchRabGDI1 y una RabGTPasa involucrada en el tr谩fico de membranas entre el endosoma y la vacuola. (5) determinar el efecto de la expresi贸n heter贸loga de SchRabGDI1 sobre los par谩metros fisiol贸gicos en plantas transg茅nicas de A. thaliana durante el estr茅s salino. Adicionalmente, se (6) determino el efecto de la expresi贸n heter贸loga de este gen sobre la endocitosis en condiciones no estresantes y sobre la (7) distribuci贸n intracelular del sodio en ra铆ces de plantas de A. thaliana control y heter贸logas para SchRabGDI1 durante el estr茅s salino. Nuestros resultados muestran que SchRabGDI1 tiene un mayor nivel de acumulaci贸n de transcritos en tejido radicular y que comparte las caracter铆sticas filogen茅ticas y los dominios estructurales caracter铆sticos presente en este grupo de prote铆nas. Adem谩s, la complementaci贸n de la levadura mutante sec19-1 con SchRabGDI1 permiti贸 corregir el fenotipo termosensible, demostrando la actividad funcional de SchRabGDI1. Mediante los estudios de BiFC se logr贸 comprobar que SchRabGDI1 es capaz de interactuar in-vivo con una RabGTPasa clave de la ruta endosoma-vacuola. Adicionalmente, la sobreexpresi贸n de SchRabGDI1 evidencio una mejora en par谩metros fisiol贸gicos como, la disminuci贸n en la acumulaci贸n de especies reactivas de ox铆geno (EROs), mayor peso fresco de las pl谩ntulas, lo cual estaba acompa帽ado de un aumento en la tasa de endocitosis y un aumento en el contenido de Na+ en sus vacuolas comparado a lo exhibido por las plantas silvestres, bajo las mismas condiciones de estr茅s salino. Este trabajo aporta nuevas evidencias acerca del papel del tr谩fico vesicular intracelular, y su participaci贸n durante el estr茅s salino, en relaci贸n con la expresi贸n heter贸loga de SchRabGDI1 en la planta modelo Arabidopsis thaliana. // ABSTRACT: Under stress situations, plants develop strategies which allow them to increase their basal tolerance levels. Some strategies include the activation of genes involved in the vesicular traffic routes. This argument is supported by researches that show an increase in vesicular dynamics when plants are subjected to salt stress. Additionally, it has been proved that the constitutive expression of some vesicular trafficking genes in model plants showed satisfactory results in the increasing of salt tolerance. Previous researches (of our team) on the wild tomato species Solanum chilense (Dunal) Reiche, high tolerant to salinity, have permitted the identification of a transcript which it is induced in response to salt stress. Databases analysis revealed that the nucleotide sequence of this transcript had a high identity degree with the gene that codifies for a GDP dissociation inhibitor (GDI) protein, of Rab-GDI type and due to its homology with the gene of Arabidopsis (AtGDI1), it was named SchRabGDI1.The functionality of this codified protein is related to the vesicular trafficking processes, allowing the RabGTPases extraction from the target membrane and afterwards keeping them soluble in cytoplasm, like a reservory, for a future vesicles movement. To carry out this research, following objectives were set: (1) to determinate organspecific transcriptional profile and (2) to identify the structural and phylogenetic characteristics of the codified protein by SChRabGDI1. (3) to determine the functional identity of SchRabGDI1 gene product. (4) to determinate the in vivo interaction capacity of SchRabGDI1 and a RabGTPase involved in membrane trafficking between the endosome and the vacuole. (5) to determine the variation of physiological parameters in SchRabGDI1 A. thaliana heterologous plants during salt stress. In adition it was (6) determined the effect of heterologous expression of this gene on endocytosis under non-stressful conditions and on the (7) intracellular distribution of sodium in roots of A. thaliana control and SchRabGDI1 heterologous plants during salt stress Our results show that SchRabGDI1 has a higher-level accumulation of transcripts in root tissue and it shares the phylogenetic characteristics and characteristic structural domains present in this group of proteins. Furthermore, the complementation of mutant yeast sec19- 1 strain with SchRabGDI1 allowed to correct the thermosensitive phenotype, demonstrating the functional activity of SchRabGDI1. Due to the BiFC studies, it was possible to verify that SchRabGDI1 can interact in-vivo with a SchRabGTPasa, key protein of the endosome-vacuole pathway. Additionally, the overexpression of SchRabGDI1 showed an improvement in physiological parameters such as the decrease in the accumulation of reactive oxygen species (O2-), higher seedlings fresh weight together with an increase in the endocytosis rate and increase in the of Na+ content in its vacuoles compared to what control plants exhibited under the same conditions of salt stress. This research provides with new evidence about the role of intracellular vesicular trafficking, as well as its participation during saline stress, in relation to the heterologous expression of SchRabGDI1 in the Arabidopsis thaliana model plant