Infection of hypertrofic tonsils by human metapneumovirus

O metapneumovírus humano (HMPV) é um importante agente causador de infecções respiratórias agudas (IRA), com tropismo para o epitélio respiratório e elevado impacto em morbidade e mortalidade na infância em todo o mundo. Porém, pouco se sabe sobre sua patogênese, especialmente em infecções de tecidos não epiteliais. Estudos prévios mostraram o genoma de HMPV em tecidos tonsilares de crianças com hipertrofia adenoamigdaliana. Nosso objetivo geral foi estudar a infecção por HMPV em tecidos de tonsilas de crianças sem sintomas de IRA, identificar as células-alvo e confirmar a presença de replicação de HMPV nesses tecidos, que podem ser fontes de disseminação do vírus na comunidade. Para tanto, foi realizada RT-PCR para o genoma do HMPV em tecidos linfoides utilizando o kit Taqman® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem). Citometria de fluxo foi usada para quantificar diferentes imunofenótipos de células infectadas e a localização in situ foi feita em cortes de tecido embebidos em parafina e analisados por imuno-histoquímica usando o método de SIMPLE (serial immuno-peroxidase labeling and erasing). Além das células epiteliais, HMPV foi detectado em células linfomononucleares nos centros germinativos, na zona do manto e nas áreas interfoliculares dos tecidos tonsilares. As células-alvo infectadas por HMPV foram identificadas e a análise imunofenotípica mostrou que células naturalmente infectadas foram positivas para marcadores CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, CD123 e CD14. Observou-se que células linfoides foram mais frequentemente infectadas em amígdalas, enquanto células mieloides foram mais frequentemente infectadas em adenoides. Um dos principais achados deste estudo foi alta frequência de macrófagos M2 (CD206 + CD80 +), e não M1, infectados em ambos os tecidos. Além de detectar macrófagos positivos para HMPV in vivo, foi demonstrada a suscetibilidade à infecção pelo HMPV em linhagem celular de macrófagos. HMPV infeccioso foi recuperado de amígdalas humanas em cultura de células, induzindo efeito citopático caracterizado com formação de sincícios, arredondamento celular e extensa ruptura da monocamada, o que foi confirmado por imunocitoquímica. O presente estudo mostra pela primeira vez que o HMPV infecta tonsilas hiperplásicas de crianças assintomáticas, que podem assim ser potenciais reservatórios do vírus, um achado significante para a epidemiologia do vírus.Human metapneumovirus (HMPV) is an important causative agent of acute respiratory infections (ARI), which tropism for the respiratory epithelium is known and a leading cause of childhood morbidity and mortality worldwide. However, little is known about the pathogenesis of HMPV, especially infections of tissues other than the airways epithelia. We have previously reported that HMPV genome was detected in tonsillar tissue taken from children with hyperplastic palatine tonsils and adenoids. In the present study, we analyzed HMPV infection in tonsillar tissues from asymptomatic children, identify target cells and investigate HMPV replication in these tissues, raising the possibility that hyperplastic tonsils may be sources of HMPV for the community. To achieve our goal, RT-PCR assay was performed to detect genome HMPV in lymphoid tissues using Taqman® Universal PCR Master Mix Kit (Applied Biosystem). We used flow cytometry to quantify infected phenotypes and in situ localization was performed in sliced tissues embedded in paraffin to perform immunohistochemistry followed by SIMPLE (serial immuno-peroxidase labeling and erasing). In addition to epithelial cells, we were also able to detect HMPV in germinal centers, mantle zone and in interfolicular region. Moreover, serial immunohistochemical stainings showed that naturally infected cells were positive for CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, CD123 and CD14 markers. We observed that lymphoid cells were the most frequently infected cell types in palatine tonsils, whereas HMPV positive myeloid cells were more frequently detected in adenoids. One of the main findings of this study was the high frequency of M2 and not M1 infected macrophages (CD206+CD80+) in both tissues. In addition to detect HMPV positive macrophages in vivo, the susceptibility to HMPV infection was demonstrated. Infectious HMPV from human tonsils was recovered in cell culture with visible cytopathic effect, characterized by syncytia formation, cell rounding and extensive monolayer disruption, which was confirmed by immunocytochemistry. The present study shows for the first time that HMPV infects hyperplastic tonsils of asymptomatic children, which may thus be potential reservoirs of the virus, a significant finding for the epidemiology of the virus

Analysis of viral gene expression in exosomes isolated from serum of HTLV-1-infected patients

Duas patologias principais estão associadas ao HTLV-1: a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). O mecanismo pelo qual ocorre o desenvolvimento destas doenças em apenas 1 a 5% dos indivíduos infectados é desconhecido. Sabe-se que diversos fatores estão associados ao desenvolvimento destas patologias, como carga proviral, características celulares, genéticas e imunológicas do hospedeiro. No entanto, tais mecanismos não foram totalmente elucidados e novas abordagens de estudos são necessárias para a compreensão da patogênese viral. Nesse sentido, vários estudos relatam o papel dos exossomos no desenvolvimento de infecções virais como HIV, EBV e HCV através do transporte de componentes incluindo proteínas, RNAm e miRNA. A possibilidade da transferência do conteúdo viral por essas vesículas para células não infectadas na ausência de vírus é um mecanismo intrigante. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo isolar os exossomos diretamente do soro de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e comparar o conteúdo dessas vesículas quanto à expressão dos genes virais tax e HBZ entre os grupos assintomático e sintomático. Para tanto, os exossomos foram isolados por precipitação polimérica (Exoquick(TM)) e caracterizados por Western Blot (expressão dos marcadores CD9, CD81, Alix e citocromo c) e Análise de Rastreamento de Nanopartículas (tamanho e concentração). Além disso, o conteúdo dos exossomos foi analisado por PCR em tempo real para quantificação dos genes virais regulatórios tax e HBZ. Por fim, no intuito de estabelecer o papel dos exossomos como biomarcadores para o desenvolvimento da HAM/TSP, os níveis de expressão destes genes foram associados à carga proviral do HTLV-1. Os transcritos de RNAm de tax e HBZ foram detectados apenas em exossomos isolados do soro dos indivíduos sintomáticos, com ausência nos assintomáticos. Além disso, a expressão de tax e HBZ nos exossomos dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 foi correlacionada positivamente com a CPV. Dessa forma, os resultados sugerem que os exossomos podem desempenhar importante papel na patogênese da mielopatia, através do transporte de genes virais de uma célula infectada para não-infectada. No entanto, mais estudos que relacionam o papel dos exossomos na infecção pelo HTLV-1 são necessários.Two major pathologies has been associated with HTLV-1 infection: adult T- cell leukemia/lymphoma (ATLL) and HTLV-1 associated myelopathy/ tropical spastic paraparesis (HAM / TSP). The mechanism which is responsible for the appearance of these diseases in only 1 to 5% of the infected individuals is unknown. Is known that several factors has been related to the development of these diseases, such as proviral load and cellular, genetic and immunological characteristics of the host. However, these mechanisms have not been fully elucidated and new approaches are necessary to understand the viral pathogenesis. Thus, several studies have reported the involvement of exosomes in the development of the HIV, HCV, and EBV viral infections carrying components including proteins, mRNA and miRNA. The possibility of transfer of viral content via these vesicles to uninfected cells in the absence of virus is an intriguing mechanism. Therefore, this proposal aimed to isolate exosomes from serum of HTLV-1 infected patients and compare the content of these vesicles regarding viral gene expression of tax and HBZ between asymptomatic and symptomatic group. For this, the exosomes were isolated by polymeric precipitation (Exoquick(TM)) and characterized by Western Blot (expression of markers CD9, CD81, and Alix) and Nanoparticle tracking Analysis (size and concentration). Furthermore, the exosomes content were analyzed by real-time PCR for the quantification of tax and HBZ regulatory viral genes. Finally, to establish the role of exosomes like biomarkers to HAM/TSP development, levels of these genes were associated with proviral load of HTLV-1. Viral mRNA transcripts including tax and HBZ were found only in exosomes isolated from serum of symptomatic individuals and absence in assymptomatic. Furthermore, tax and HBZ expression in exosomes from HTLV-1 infected individuals were positive correlated with proviral load. Thus, the results suggests that exosomes can able to develop important role in myelopathy pathogenesis carrying viral genes of infected cell to uninfected cell. However, more studies that relate the role of exosomes in HTLV-1 are neede