Effect of hydrogen peroxide associated with methylene blue conjugated to ?-cyclodextrin in photodynamic antimicrobial chemotherapy with laser or Led in "S. mutans" biofilm

Orientador: Carolina Steiner Oliveira AlarconDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Técnicas inovadoras de controle do biofilme de "Streptococcus mutans (S. mutans)" são importantes para a prevenção da doença cárie. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da adição de peróxido de hidrogênio ao azul de metileno conjugado à ß-ciclodextrina na terapia fotodinâmica antimicrobiana (TFDA) em modelo de biofilme de "S. mutans" utilizando diferentes fontes de luz. Os grupos foram divididos em (n = 3, em triplicata): C (Controle negativo), CX ß- clorexidina 0,2% (controle positivo), F (Azul de metileno/ß-ciclodextrina), H (Peróxido de hidrogênio), FH (Azul de metileno/ß-ciclodextrina + Peróxido de hidrogênio), L (LASER), LF (LASER + Azul de metileno/ß-ciclodextrina), LH (LASER + Peróxido de hidrogênio), LFH (LASER + Azul de metileno/ß-ciclodextrina + Peróxido de hidrogênio) , LED, LEDF (LED + Azul de metileno/ß-ciclodextrina), LEDH (LED + Peróxido de hidrogênio) e LEDFH (LED + Azul de metileno/ß-ciclodextrina + Peróxido de hidrogênio). A formação de biofilme de "S. mutans" foi realizada em placa de 96 poços por 24 h com BHI suplementado com 1% (p/v) de sacarose. A solução de azul de metileno conjugado com a nanopartícula (32 uM), o peróxido de hidrogênio (40 uM) e a solução de azul de metileno conjugado com a nanopartícula mais o peróxido de hidrogênio foram deixados nos poços por 5 min. As irradiações da TFDA foram conduzidas com laser ('lambda' = 660 nm), 9 J e 320 J/cm2 e com LED ('lambda' = 660 nm), 8 J e 0,8 J/cm2, ambos por 150 s. A redução microbiana foi avaliada pela contagem de micro-organismos viáveis do biofilme após os respectivos tratamentos, de acordo com os grupos, em meio de cultura seletivo mitis salivarius agar (MSA). A normalidade e homocedasticidade dos dados foram avaliadas pelos testes Shapiro-Wilk e Levene, respectivamente, e os resultados foram submetidos ao teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, seguido do teste post-hoc de Dunn para evidenciar diferenças (a = 5%). Os grupos LF, LH, LFH, LEDF, LEDH, LEDFH reduziram significativamente as contagens de "S. mutans" em comparação com o grupo C e as reduções em log foram de 1,87, 1,94, 2,19, 0,91, 0,92, 1,33, respectivamente. Não houve diferença significativa na redução microbiana entre os grupos com adição de peróxido de hidrogênio (LFH e LEDFH), comparados com os grupos LF e LEDF e, por fim, no grupo controle positivo, não houve crescimento bacteriano, porém, sem diferença significativa em relação aos grupos LF, LH, LFH. Concluiu- se que a adição do peróxido de hidrogêneo ao fotossensibilizador não resultou em efeito sinérgico da TFDA independente da fonte de luz utilizada; e o peróxido de hidrogênio se comportou como um fotossensibilizador, uma vez que reduziu o número de "S. mutans" quando associado a diferentes fontes de luzAbstract: Innovative techniques to control "S. mutans" biofilm are important for the prevention of caries disease. The aim of this study was to evaluate the effect of the addition of hydrogen peroxide to ß-cyclodextrin-conjugated methylene blue in photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT) in "S. mutans" biofilm model using different light sources. The groups were then divided into (n = 3, in triplicate): C (negative control), CX - chlorhexidine 0.2% (positive control), P (methylene blue/ß-cyclodextrin), H (Hydrogen Peroxide), PH (methylene blue/ß-cyclodextrin + Hydrogen Peroxide), L (Laser), LP (Laser + methylene blue/ß-cyclodextrin), LH (Laser + Hydrogen Peroxide), LPH (Laser + methylene blue/ß-cyclodextrin + Hydrogen Peroxide), LED, LEDP (LED + methylene blue/ß-cyclodextrin) , LEDH (LED + Hydrogen Peroxide) and LEDPH (LED + methylene blue/ß-cyclodextrin + Hydrogen Peroxide). The "S. mutans" biofilm formation was performed in a 96-well plate for 24 h with BHI supplemented with 1% (w/v) sucrose. The methylene blue solution conjugated to the nanoparticle (32 uM), hydrogen peroxide (40 uM) and the methylene blue solution conjugated to the nanoparticle plus hydrogen peroxide were left in the wells for 5 min. Irradiations of the PACT were conducted with laser ('lambda' = 660 nm), 9 J and 320 J/cm2 and with LED ('lambda' = 660 nm), 8 J and 0.8 J/cm2, both for 150 s. The microbial reduction was evaluated by the counting of viable microorganisms of the biofilm after the respective treatments, according to the groups, in selective culture medium mitis salivarius agar (MSA). The normality and homoscedasticity of the data were evaluated by the Shapiro-Wilk and Levene tests, respectively, and the results were submitted to the Kruskal-Wallis non-parametric test, followed by Dunn's post-hoc test to show differences (a = 5%). The groups LP, LH, LPH, LEDP, LEDH, LEDPH significantly reduced the counts of "S. mutans" compared to C group and the log reductions were of 1.87, 1.94, 2.19, 0.91, 0.92, 1.33, respectively. No significant difference was found in the microbial reduction between the groups with hydrogen peroxide addition (LPH and LEDPH), compared to the LP and LEDP groups, and, finally, in the positive control group, no bacterial growth was observed, nevertheless, with no significant difference in relation to the LP, LH, LPH groups It was concluded that (1): the addition of hydrogen peroxide to the photosensitizer did not result in a synergistic effect of PACT; (2): hydrogen peroxide behaved as a photosensitizer as it reduced the number of "S. mutans" when associated with different light sourcesMestradoOdontopediatriaMestra em Odontologia132211/2017-32017/03263-3CNPQFAPES