Funktion von IRAG für cGMP-Kinase-I-Komplexe sowie für die InsP3R-I-Phosphorylierung

Die cGMP-abhängigen Proteinkinasen (cGKs) haben als Bestandteile des NO/cGMP/cGK-Signalwegs in einer Vielzahl von Organen und Zellen eine große physiologische Bedeutung. Sie werden unter anderem in der glatten Muskulatur von Blutgefäßen oder Gastrointestinaltrakt, in Thrombozyten, in der Niere und im Gehirn exprimiert. Darin spielen cGKs eine wichtige Rolle zum Beispiel bei der Vasorelaxation oder der Hemmung der Thrombozytenaggregation. Es werden zwei Isoformen der cGKI, die in ihrem N-Terminus unterschiedlichen Kinasen cGKIα und cGKIβ, und die cGKII unterschieden. Die mannigfaltigen Effekte der cG-Kinasen werden durch ihre verschiedenen Substratproteine vermittelt. Diese werden durch die Kinasen phosphoryliert und dadurch aktiviert oder gehemmt, oder interagieren mit ihnen in diversen Proteinkomplexen. Ein Substratprotein der cGKIβ-Isoform ist IRAG, das InsP3Rezeptor-assoziierte cGMP-Kinasesubstrat. Dieses ist in der Membran des endoplasmatischen Retikulums verankert und liegt in einem Makrokomplex mit der cGKIβ und dem Calciumkanal InsP3R-I (Inositoltrisphosphatrezeptor I) vor. Durch cGKIβ-vermittelte IRAG-Phosphorylierung wird die InsP3-induzierte Calciumfreisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum gehemmt. Der Anstieg der intrazellulären Calciumionenkonzentration ist Voraussetzung für eine Vielzahl physiologischer Prozesse, wie Thrombozytenaggregation oder Muskelkontraktion. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Funktion einer cGKI-abhängigen Phosphorylierung des InsP3R-I untersucht. Bislang war unklar, ob die periphere S2--Form des InsP3R-I, welche auch in Thrombozyten exprimiert wird, direkt durch die cGK phosphoryliert werden kann, und ob dadurch die Calciumfreisetzung beeinflusst wird. Zur Klärung dieser Fragestellung wurde die cGMP-stimulierte Phosphorylierung des InsP3R-I in murinen Wildtyp- und IRAG-KO-Thrombozyten untersucht. Sowohl die Phosphorylierung an Ser1755, der bekannten cGK-Phosphorylierungsstelle, als auch die Gesamtphosphorylierung des Rezeptors waren in Wildtyp- und IRAG-KO-Blutplättchen gleich. Unter den gleichen Bedingungen, unter welchen die InsP3R-I-Phosphorylierung detektiert wurde, wurden Aggregationsexperimente durchgeführt. Durch cGMP konnte die Aggregation der Wildtyp-, aber nicht die der IRAG-KO-Thrombozyten gehemmt werden. Daraus lässt sich schließen, dass die Phosphorylierung des InsP3R-I nicht erforderlich oder nicht ausreichend für eine Hemmung der Aggregation ist. Die weitere Charakterisierung der Interaktion zwischen IRAG und cGKIβ war ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Untersuchungen. Die IRAG-Interaktionsstelle mit der cGKIβ war mittels Hefe-zwei-Hybrid-System bereits im Jahr 2001 identifiziert worden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nun eine IRAG-Mutante hergestellt, bei der jene Interaktionsstelle fehlt (IRAG∆Int). In cGMP-Agarosefällungen zeigte sich, dass durch die Deletion die Interaktion tatsächlich aufgehoben wird. Darüber hinaus wurden das IRAG∆Int-Protein und das WT-IRAG gemeinsam mit der cGKIβ in COS-7-Zellen exprimiert. Es konnte beobachtet werden, dass das WT-IRAG die Kinase im Zytosol verankert. Bei Expression von IRAG∆Int war jedoch nach cGMP-Stimulation der Zellen eine Translokation der Kinase in den Zellkern zu beobachten. Dies kann durch die fehlende Interaktion mit der Kinase erklärt werden. Zusätzlich zum trimeren Makrokomplex sind in der Literatur weitere cGK-Komplexe beschrieben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob diese Interaktionen auch in murinen Thrombozyten oder in der glatten Muskulatur des Colons auftreten. Es wurden WT- und IRAG-KO-Mäuse verwendet, um herauszufinden, ob IRAG ein essentieller Bestandteil der Komplexe ist. Außerdem konnte dadurch der Aufbau der Proteinkomplexe weiter analysiert werden. Es zeigte sich, dass neben dem InsP3R-I auch der InsP3R-III einen Komplex mit IRAG und cGKIβ bildet. Die dritte InsP3R-Isoform, der InsP3R-II, konnte nicht als Interaktionspartner nachgewiesen werden. Sowohl in Thrombozyten, als auch in Colongewebe konnte aber Phospholamban, welches die Aufnahme von Ca2+ ins ER reguliert, als zusätzlicher Bestandteil des Makrokomplexes identifiziert werden. Zudem konnte eine Interaktion zwischen Phospholamban und der cGKIα-Isoform detektiert werden. In der Literatur wurde auch die Phosphodiesterase 5 als Bestandteil des trimeren Makrokomplexes in humanen Thrombozyten beschrieben. Dies konnte in murinen Blutplättchen und Colongewebe nicht bestätigt werden. Ebenso wurde keine Interaktion zwischen der cGKIα-Isoform und MYPT-1, der regulatorischen Untereinheit der Myosinleichtkettenphosphatase, detektiert, obwohl diese Wechselwirkung von mehreren anderen Arbeitsgruppen dargestellt wurde. Diese Interaktion wurde in Experimenten mit murinen Colon- und Uteruslysaten untersucht. Neben dem trimeren Komplex existieren somit noch verschiedene andere cG-Kinasekomplexe, deren Funktion und Interaktionsstellen jedoch häufig noch unklar sind

Methods for identification of cGKI substrates

The cGMP-dependent protein kinases (cGK), which belong to the family of serine/threonine kinases, exhibit their diverse functions in cells through interaction with a variety of substrate proteins. Several substrates were identified and the interactions studied using different methods inter alia co-immunoprecipitation (Co-IP) and cGMP-agarose affinity purification. In the following chapter, we will describe the preparation of cell or tissue lysates, the procedures of cGMP-agarose affinity purification and co-immunoprecipitation, and finally the separation and analysis of the protein complexes by SDS-PAGE or mass spectrometry