共焦点レーザー顕微鏡を用いたペプチドの細胞内動態解析と脳実質細胞標的化への応用

金沢大学薬学部脳毛細血管内皮細胞の吸着介在型エンドサイトーシス(AME)機構を利用したペプチドの脳内送達を目指して、蛍光標識した合成塩基性テトラペプチド(H-MeTyr-Arg-MeArg-D-Leu-CONH(CH_2)_8NH_2、NBD-C-001-C8)をモデル化合物として、培養脳毛細血管内皮細胞における細胞内動態を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析した。更に放射性標識ペプチドを用いて定量的な実験も併せて行った。その結果、1.NBD-C-001-C8の細胞への内在化(取り込み)過程を、共焦点レーザー顕微鏡によって得られる光学的断層像について経時的に形態観察を行ったところ、細胞内にエンドサイトーシスを示す顕著な顆粒状染色が見られ、細胞表面吸着と細胞内移行とが分別可能であることがわかった。2.蛍光標識された顆粒は、取り込み約10分から30分にかけてluminalからanti-luminal方向へと経時的に深部へと移行した。このことは、画像解析によりその蛍光強度を定量化することによっても確認され、確かにペプチドの細胞への内在化が進行していることを実証することに成功した。3.ペプチドの内在化はプロタミン、ダンシルカダベリン等により阻害され、AMEによる内在化であることが示された。4.細胞の糖鎖選択的消化酵素処理により細胞表面の吸着サイトとしてヘパラン硫酸の関与が示唆された。5.以上の結果は放射標識ペプチド([^I]001-C8)を用いた定量実験の結果と良い一致を示した。これらにより、脳毛細血管内皮細胞のAME機構を蛍光標識体を用いた形態的観察、及び放射性標識体を用いた定量実験それぞれの結果により実証することに成功した。本研究の成果は、これまで困難であったペプチド性医薬品の脳送達が、分子に適当なカチオン性修飾を施すことにより可能になることを示すものと考えられる。研究課題/領域番号:07772237, 研究期間(年度):1995出典：研究課題「共焦点レーザー顕微鏡を用いたペプチドの細胞内動態解析と脳実質細胞標的化への応用」課題番号07772237（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-07772237/）を加工して作

小腸オリゴペプチド輸送体の組織及び細胞内分布の免疫化学的解析と薬物輸送特性

金沢大学医薬保健研究域薬学系1.オリゴペプチド輸送担体cDNAクローン(PepT1)の薬物輸送能の検討PepT1 cRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に微注入しその遺伝子産物の輸送活性を、ceftibuten及びcefadroxilをモデル基質として測定した結果、両薬物ともジペプチド[^C]GlySarと同様の輸送を示した。このことから本輸送担体がβ-ラクタム抗生物質をも基質として受け入れ輸送することが明らかとなった。また[^C]GlySarとceftibuten及びcefadroxilとは共存により相互に阻害が見られたことから、これらが全て同一の認識部位を介して輸送されてることが示された。PepT1の翻訳開始領域付近に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて小腸の全mRNAにより発現する輸送に対する阻害効果を検討した結果、ほぼバックグランドレベルまで抑制された。ことから、上記薬物の消化管吸収が本輸送担体によってほぼ説明できることも示すことが出来た。2.PepT1の小腸上皮細胞における細胞内局在性および組織間分布の検討PepT1のカルボキシ末端部分のペプチドを合成、免疫しポリクローナル抗体(anti-PepT1/C)を得ることが出来た。この抗体を用いて、刷子縁膜及び側基底膜のWestern解析、また小腸その他の臓器の組織切片固定標本に対して免疫組織染色を行い、光学顕微鏡及び電子顕微鏡レベルで観察した結果、PepT1が小腸上皮細胞の刷子縁膜にのみ局在する事を明らかにすることが出来た。3.以上の結果からオリゴペプチド輸送担体として単離したcDNAクローンPepT1がβ-ラクタム抗生物質に対しても輸送活性を持ち、小腸上皮細胞の刷子縁膜に局在し、薬物の消化管からの吸収に寄与していることを実証することが出来た。研究課題/領域番号:08772166, 研究期間(年度):1996出典：研究課題「小腸オリゴペプチド輸送体の組織及び細胞内分布の免疫化学的解析と薬物輸送特性」課題番号08772166（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-08772166/）を加工して作

トランスポーター発現アデノウイルスベクターを用いたペプチド様抗がん剤の脳腫瘍送達

金沢大学大学院・自然科学研究科本研究は、ペプチド様抗がん剤の脳移行障壁となっている血液脳関門にペプチドトランスポーターであるhPEPT1を発現させ、抗がん剤の脳移行性を向上させることを目的として、ペプチド性抗がん剤を輸送するhPEPT1と黄色蛍光タンパク質とのキメラ化タンパク質を発現するアデノウイルスベクターAdhPEPT1-EYFPを作製した。AdhPEPT1-EYFPによるhPEPT1のペプチド輸送活性のin vitroでの発現を、研究代表者等がこれまでに不死化、樹立したラット脳毛細血管内皮細胞RBEC1を用いて[^3H]グリシルサルコシンを基質に検討した。その結果、AdhPEPT1-EYFPを感染させたRBEC1で、経時的な[^3H]グリシルサルコシン取込みの上昇がウイルスの用量依存的に見られた。AdhPEPT1-EYFP感染細胞による[^3H]グリシルサルコシン取り込みには、hPEPT1の特徴pH依存性および10mM非標識グリシルサルコシンによる阻害がみられた。RBEC1細胞におけるhPEPT1-EYFPキメラ遺伝子のmRNAレベルでの発現は、RT-PCR法により確認した。発現したhPEPT1-EYFPキメラタンパク質の細胞膜への発現は蛍光顕微鏡を用いて確認した。正常細胞である初代培養脳毛細血管内皮細胞を用いても検討を行ったが、RBEC1と同様な結果が得られた。hPEPT1-EYFPのin vitroでの発現が確認できたことから、in vivo発現についても予備的な検討を行った。Takasato等の方法に従い、ラットの内径動脈にAdhPEPT1-EYFPウイルス溶液を灌流し感染を行った。本実験は手術法が複雑であることから、手術が成功した2例についてのみ感染動物を2日間飼育した後、Oldendolfに従ってbrain uptake index法によりペプチド脳移行性の検討を試みた。その結果、[^3H]カルノシンの脳移行性は非感染動物と比べて上昇する傾向がみられた。以上、本ベクターを用いることによって、in vivoでhPEPT1機能を誘導できる可能性が示された。また、がん細胞での発現が認められるOCTNおよびOATPトランスポーターの検討も行った。研究課題/領域番号:12217054, 研究期間(年度):2000出典：研究課題「トランスポーター発現アデノウイルスベクターを用いたペプチド様抗がん剤の脳腫瘍送達」課題番号12217054（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12217054/）を加工して作

ペプチドトランスポーターを利用した腫瘍特異的抗がん剤デリバリー

金沢大学理工研究域本研究は、正常組織においてはその発現が小腸および腎臓の上皮細胞刷子縁膜に局在するオリゴペプチドトランスポーターを分子標的とした腫瘍特異的な抗がん薬の送達が可能であるかを検証することを目的として検討を行った。そこで、ヒト肺、乳腺、胃、結腸、膵臓、膀胱、子宮頸部、皮膚、骨あるいは白血球、リンパ球に由来する各種株化腫瘍細胞を培養後、全RNAを調製し、Super Script II Reverse TranscriptaseおよびOligo dT primerを用いてcDNAを合成した。得られたcDNAを用いてLight Cycler(Roche Diagnostics)によりリアルタイム定量PCR解析を行った。その結果、既知の代表的なオリゴペプチドトランスポーターであるPEPT1の発現量は白血病細胞由来ML-1細胞で最も高く、次いでNakajimaおよびCaco2に顕著な発現が見られた。PEPT2は殆どの細胞に発現が見られた。これらペプチドトランスポーターの発現量を放射性標識グリシルザルコシンおよびベスタチンの取り込み活性と比較した結果、トラスポーター発現量と輸送活性とが必ずしも一致しないことから、新規のペプチドトランスポーターの存在が示唆された。ヒトゲノムデータベースに対して検索を行ったところ、PEPT1およびPEPT2に相同性を持つトランスポーター様の構造を有する新規遺伝子PEP3の存在が認められたことから、この分子がん細胞に発現する第3のペプチドトランスポーターである可能性が考えられた。これまでの研究成果をふまえて、今後は例えば、PEPT1をin vivoでの発現効率が高いアデノウイルスベクターを用いて、in vivoで本来PEPT1を発現しない臓器に強制発現することにより新たな輸送機能を発現させ、その基質となる薬物の体内動態を能動的に制御する等、薬効標的部位におけるトランスポーターの発現を積極的に制御することによる新たな能動的薬物動態制御法の樹立を目指す必要があるものと考えられる。研究課題/領域番号:12771460, 研究期間(年度):2000-2001出典：「ペプチドトランスポーターを利用した腫瘍特異的抗がん剤デリバリー」研究成果報告書　課題番号 12771460（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12771460/)を加工して作

小腸モノカルボン酸輸送体の組織及び細胞内分布の免疫化学的解析と薬物輸送の分子機構

金沢大学医薬保健研究域薬学系・MCT1のカルボキシ末端16アミノ酸残基に対する特異抗体(anti-MCT1/C16)を調製することに成功した。Anti-MCT1/C16は、既にMCT1タンパク質の存在が明らかなラット赤血球及び心臓の膜画分に対しても交差反応を示した。・研究代表者らがこれまでモノカルボン酸の輸送実験に用いてきたラット空腸刷子縁膜(BBM)小胞をCa^沈殿法により調製し、Western解析を行ったところ、MCT1と考えられる約42kDaのタンパク質を検出することができた。・このことから、膜小胞を用いた輸送実験で観察されたモノカルボン酸輸送にMCT1が関与していたことが示唆された。・免疫組織化学的手法を用いたラット消化管各部におけるMCT1の臓器分布と細胞内局在性の検討を行ったところ、消化管全体を通したMCT1の分布は、胃、小腸の一部、盲腸、結腸で多く、空腸、回腸では相対的に少ないことが明らかとなった。・MCT1はすべての臓器で、主に未分化な細胞の側基底膜(BLM)側に多い傾向がみられたことから、未分化な細胞の分化に必要なエネルギーを積極的に取り入れるのに機能していることが考えられた。また、盲腸と結腸ではそれ以外の細胞のBLM側にもみられた。下部消化管に棲息する嫌気性細菌は未消化食物や分泌液、脱落した上皮細胞に含まれる糖質を嫌気的に分解して増殖のためのエネルギーを得るが、その代償として主に酢酸、プロピオン酸、酪酸なだの短鎖脂肪酸が管腔内に蓄積することが知られており、このことと、深く関係しているのではないかと思われた。また、空腸に着目するとcryptでは根元付近のBLMに強くみられ、絨毛部では微絨毛にはMCT1がはっきりとは存在せず側膜上部、特にtight junction直下に、強くみられた。・以上の結果とMCT1がプロトン共輸送により駆動されることを考えあわせることにより、本輸送担体が消化管管腔内からのモノカルボン酸系薬物の吸収に関与する可能性が示唆された。研究課題/領域番号:09771974, 研究期間(年度):1997 – 1998出典：「小腸モノカルボン酸輸送体の組織及び細胞内分布の免疫化学的解析と薬物輸送の分子機構」研究成果報告書　課題番号09771974（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-09771974/)を加工して作

Disposition Kinetics of Taxanes in Peritoneal Dissemination

Treatment of cancers in the abdominal cavity, such as peritoneal dissemination, is difficult, but in principle intraperitoneal administration of anticancer drugs is expected to be preferable to systemic administration. Taxane anticancer drugs are used to treat gastric cancer patients with peritoneal dissemination. They are administered as micellar preparations, Taxol and Taxotere, which consist of paclitaxel in Cremophor EL (crEL) and docetaxel in Polysorbate-80 (PS-80), respectively. In this paper we review the disposition kinetics of taxane anticancer drugs after intraperitoneal administration in peritoneal dissemination patients and animal models and also discuss the effect of the surfactant vehicle on the behavior of taxanes

Disintegration of lysosomes mediated by GTP γS-treated cytosol: Possible involvement of phospholipases

金沢大学附属病院薬剤部We showed previously that cytosol treated with guanosine 5\u27-O-(3-thiotriphosphate) (GTP-γS) disintegrated lysosomes in vitro in time-, temperature-, and dose-dependent manners. This also requires ATP, however, the latter can be substituted with deoxy-ATP, ADP, or ATPγS, suggesting no requirement of ATP hydrolysis. The lysis was inhibited by several chemical modifiers, including N-ethylmaleimide, 7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole, and 4,4\u27-diisothiocyanatostilbene-2,2\u27-disulfonic acid, and by various phospholipase inhibitors (trifluoperazine, p-bromophenacyl bromide, nordihydroguaiaretic acid, W-7, primaquine, compound 48/80, neomycin, and gentamicin), but not by ONO-RS-082, an inhibitor of phospholipase A2. The reaction was also inhibited by phospholipids (phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidic acid, and phosphatidylcholine) and diacylglycerol. Among the phospholipase A2 hydrolysis products of phospholipids, unsaturated fatty acids (oleate, linoleate, and arachidonate) and lysophospholipid (lysophosphatidylcholine) by themselves broke lysosomes down directly, whereas saturated fatty acids (palmitate and stearate) had little effect. We found that GTPγS-stimulated cytosolic phospholipase A2 activity was highly sensitive to ONO-RS-082. These results suggest the participation of phospholipase(s), though not cytosolic phospholipase A2, in the GTPγS-dependent lysis of lysosomes

Elimination of teicoplanin by adsorption to the filter membrane during haemodiafiltration: Screening experiments for linezolid, teicoplanin and vancomycin followed by in vitro haemodiafiltration models for teicoplanin

Pharmaceutical agents directed against methicillin-resistant Staphylococcus aureus can be eliminated during haemodiafiltration, not only by diffusion and ultrafiltration, but also by adsorption onto haemofilters. The latter may be affected by the binding of agents to serum albumin. The present study therefore investigated the affinity of anti-methicillin-resistant Staphylococcus aureus agents (teicoplanin, linezolid, vancomycin) for haemofilters and the pharmacokinetic properties of teicoplanin during haemodiafiltration. Linezolid, teicoplanin and vancomycin were first screened for their in vitro affinity for three different kinds of filter membranes: polysulfone, polyacrylonitrile and polymethylmethacrylate. Only teicoplanin showed significant filter-binding activity. An in vitro haemodiafiltration circulation model was then developed that incorporated a one-litre beaker containing Krebs-Ringer\u27s bicarbonate solution with/without human albumin (0 or 3 g/dl) as an artificial plasma. Teicoplanin (initial concentration 50 μg/ml, representing the maximum plasma concentration (Cmax) resulting from a typical clinical dosage) was circulated throughout the beaker. Teicoplanin concentrations in the \u27plasma\u27 and ultrafiltrate were determined by high performance liquid chromatography. In the screening experiment, teicoplanin was predominantly adsorbed onto polysulfone and polymethylmethacrylate membranes. Furthermore, teicoplanin was primarily eliminated by adsorption onto these filters during in vitro haemodiafiltration. Albumin significantly reduced both haemodiafiltration clearance and the adsorption-dependent elimination, although there were complex but significant interactions between albumin and the filter membrane. Elimination of teicoplanin in an in vitro haemodiafiltration model was largely due to adsorption onto polysulfone and polymethylmethacrylate haemofilters. Future clinical studies should likely be designed to evaluate present recommendations of teicoplanin dosages in patients on haemodiafiltration

Change in pharmacokinetics of mycophenolic acid as a function of age in rats and effect of coadministered amoxicillin/clavulanate

Changes of mycophenolic acid (MPA) pharmacokinetics with aging were investigated in rats. We also compared the effect of concomitant amoxicillin/clavulanate combination (CVA/AMPC) on the pharmacokinetics of MPA in 4-week-old and 12-week-old rats (the package insert of CVA/AMPC warns of possible interaction with MPA). Four-week-old rats showed a 1.4-fold higher total body clearance of MPA and a lower volume of distribution of MPA (65%), compared to the values in 12-week-old rats. However, the difference in MPA pharmacokinetics disappeared when enterohepatic circulation was eliminated by bile duct cannulation (BDC). Concomitant CVA/AMPC significantly reduced plasma MPA concentration in intact rats of both age groups, and the age-dependent difference of MPA pharmacokinetics was no longer apparent. The effect of CVA/AMPC was not seen in rats that had undergone BDC, suggesting that the drug-drug interaction can be attributed to inhibition of enterohepatic circulation by CVA/AMPC. These results indicate that the aging-related alteration of MPA pharmacokinetics is a consequence of immature enterohepatic circulation in 4-week-old rats. Higher doses of MPA may be necessary in juveniles. © 2012 The Pharmaceutical Society of Japan

Enhancement of Zidovudine Uptake by Dehydroepiandrosterone Sulfate in Rat Syncytiotrophoblast Cell Line TR-TBT 18d-1

ABSTRACT: AZT (3-azido-3-deoxythymidine; zidovudine), which is used for the prevention of mother-to-child transmission of HIV-1, is transplacentally transferred to the fetus across the blood-placenta barrier, which is composed of syncytiotrophoblasts. We recently showed that apical uptake of AZT by syncytiotrophoblasts is mediated by saturable transport system(s) in the TR-TBT 18d-1 cell line, and the cellular accumulation of AZT was increased in the presence of dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS). Here, we aimed to clarify the mechanism of this effect of DHEAS. Inhibitors of efflux transporters, including breast cancer resistance protein, P-glycoprotein, and multidrug resistance proteins, had little effect on the cellular accumulation of AZT in TR-TBT 18d-1. Kinetic study revealed that the rate constant for AZT uptake was greatly increased in the presence of 1 mM DHEAS. These results suggested that the effect of DHEAS was because of enhancement of the uptake process(es), rather than inhibition of efflux. When AZT uptake was analyzed according to the Michaelis-Menten equation, the estimated Michaelis constant, K m , for AZT uptake in the presence of 1 mM DHEAS was lower than that in its absence, whereas maximum uptake velocity, V max , and nonsaturable uptake clearance, k ns , were similar in the presence and absence of DHEAS, indicating that DHEAS may change the recognition characteristics of the transporter for AZT in TR-TBT 18d-1. Thus, the increase of AZT uptake in TR-TBT 18d-1 cells in the presence of DHEAS was concluded to be because of a DHEAS-induced change in the affinity of AZT uptake system, although the transporter responsible for AZT uptake has not been identified