La proteína Rep de geminivirus reduce la sumoilación

Los geminivirus, llamados así por la forma icosaédrica de su cápside, son una familia de virus patógenos de plantas que causan algunas de las enfermedades con mayor impacto económico a nivel mundial. Estos pequeños virus de DNA se replican en el núcleo de las células vegetales utilizando la maquinaria celular del hospedador, además de requerir de forma esencial la presencia de una de sus proteínas, denominada Rep (replication protein). Para llevar a cabo la infección, los geminivirus alteran rutas de regulación post-traduccional, lo cual consiguen mediante la interacción de algunas de sus proteínas con componentes de estas rutas1,2,3. Dos de las modificaciones post-traduccionales más importantes, la sumoilación y la ubiquitinación, que consisten en la adición mediante una cascada enzimática de pequeños péptidos (ubiquitina y SUMO) a residuos de lisina de la molécula diana, están involucradas en numerosos procesos de la planta, incluidos el desarrollo y el ciclo celular, y juegan un papel relevante en la respuesta a estreses tanto bióticos como abióticos. Trabajos previos desarrollados en nuestro grupo mostraron que la proteína Rep del geminivirus Tomato Golden mosaic virus interacciona con SCE1 (SUMO Conjugating enzyme)4, una de las enzimas que participan en la ruta de sumoilación, y PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)5,6, una proteína homotrimérica que actúa como coordinador central en la replicación y reparación del DNA y en la que las modificaciones postraduccionales juegan un importante papel regulando su interacción con otras proteínas. Posteriormente, se vio que la interacción entre Rep y SCE1 es necesaria para la infección por geminivirus y que la expresión de Rep tiene un efecto específico sobre la sumoilación de las proteínas de la planta4,7. Mediante ensayos en Escherichia coli usando el sistema de sumoilación de Arabidopsis thaliana, hemos detectado que una de estas proteína es PCNA y que su sumoilación se ve reducida por la presencia de la proteína viral. Así mismo, se ha comprobado que esa disminución se produce por un mecanismo que no implica la interacción de Rep con SCE1 e identificado las lisinas de PCNA cuya sumoilación se ve afectada. Además, utilizando un sistema de ubiquitinación en E. coli8, se comprobó si la presencia de Rep produce el mismo efecto en la ubiquitinación. Resultados preliminares indican que la proteína viral no reduce, al menos al mismo nivel, la ubiquitinación de PCNA. Se discutirán las posibles consecuencias que para el virus puede tener la interferencia en la sumoilación de PCNA.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Geminiviral protein Rep interferes in PCNA sumoylation

Rep is a multifunctional protein essential for replication of geminivirus that interferes with the sumoylation of a key protein in the DNA replication, PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). It is known that Rep is capable of interacting with a plethora of plant proteins, including PCNA. Despite the biological significance remains unknown, it’s thought that this interaction should play a key role for generating new copies of the virus genome. Therefore, in order to characterize this interaction, we study which lysines are sumoylated in tomato PCNA (SlPCNA). Considering conservation, location and presence of sumoylation domain criteria, we have identified some candidate lysines and studied how its mutation affects this protein sumoylation in Escherichia coli assays. Finally, we plan to confirm and characterize the Rep interference on SlPCNA sumoylation and determine if this interference occurs in planta.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

La proteína Rep/AL1 de geminivirus altera la sumoilación de PCNA

Los geminivirus, llamados así por la forma icosaédrica de su cápside, son una familia de virus patógenos de plantas que causan algunas de las enfermedades con mayor impacto económico a nivel mundial. Estos pequeños virus de ADN se replican en el núcleo de las células vegetales utilizando la maquinaria celular del hospedador, además de requerir la presencia de la proteína viral Rep. Rep es la única proteína del genoma del virus imprescindible para su replicación y es capaz de interaccionar con una gran variedad de proteínas del huésped. Trabajos previos de nuestro grupo demostraron que dos de esas proteínas son PCNA (Proliferating cell nuclear antigen), esencial en el metabolismo del DNA, y SCE (SUMO Conjugating Enzime), enzima que interviene en la sumoilación, uno de los principales mecanismos de modificación postraduccional que está implicado en la respuesta de la planta a estrés abiótico, en el desarrollo, el crecimiento y la respuesta a patógenos. Además, otros resultados que hemos obtenido demuestran que la expresión en Escherichia coli de la proteína Rep del begomovirus TGMV (Tomato golden mosaic virus) reduce la sumoilación de PCNA en plantas y que dicha interferencia no depende de la interacción de la proteína viral con SCE1. Para profundizar en el conocimiento de la interacción Rep-PCNA nos hemos propuesto identificar las lisinas de PCNA que se sumoilan. Teniendo en cuenta criterios de conservación, localización y presencia de dominio de sumoilación se han identificado varias lisinas candidatas y se ha estudiado cómo su mutación afecta a la sumoilación de la proteína. También nos hemos planteado confirmar y caracterizar la interferencia de Rep sobre la sumoilación de PCNA y determinar si dicha interferencia se produce en la planta.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Geminivirus replication protein decreases PCNA sumoylation at two acceptor sites

Geminiviruses are plant viruses with circular, single-stranded DNA (ssDNA) genomes that infect a broad range of plants causing substantial crop diseases worldwide. They replicate in nuclei of infected cells by using host DNA replication machinery and an essential protein encoded in their genome designated Rep (replication-associated protein). This multifunctional protein induces the accumulation of the host factors involved in replication and it is capable of interacting with a lot of plant proteins including PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), a processivity factor that coordinates a wide range of processes involved in maintenance, duplication and transmission of the genome, and the sumoylation enzyme that conjugates SUMO to target proteins (SUMO-conjugating enzyme- SCE). PCNA modification by SUMO, and also ubiquitin, has long been known to be of key importance for determining how DNA damage is processed by the replisome and for maintenance of overall genome integrity. In yeast, PCNA sumoylation has been associated to DNA repair involving homologous recombination (HR). Previously, we reported that Rep ectopic expression does not result in broad changes in the sumoylation pattern of plant cells, but it modifies the sumoylation state of selected host proteins. In this work, we show, using a reconstituted sumoylation system in Escherichia coli, that tomato PCNA is sumoylated at two residues, K254 and K164, and that co-expression of the Rep protein suppresses PCNA sumoylation at these lysines. Finally, we confirm that PCNA is sumoylated and that Rep also interferes with PCNA sumoylation in planta.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tec

Estudio de la sumoilación en el papel de la proteína Rep en el replisoma viral

Los geminivirus son una familia de virus transmitidos por insectos que infectan numerosas especies vegetales de gran interés agrícola en regiones con clima tropical y subtropical de todo el mundo, ocasionando grandes pérdidas económicas. Su genoma, compuesto por una o dos moléculas circulares de DNA monocatenario (monopartitos o bipartitos, respectivamente), contiene de cuatro a ocho genes solapados que codifican proteínas multifuncionales capaces de tomar el control de la célula vegetal y llevar a cabo una infección exitosa. De los catorce géneros descritos hasta el momento, Begomovirus es el más numeroso y el que causa un mayo impacto. Esta tesis doctoral se ha centrado en el estudio de la proteína Rep de begomovirus, la única proteína viral esencial para su replicación, capaz de promover la acumulación de los factores del huésped que forman el replisoma. Entre las numerosas proteínas celulares con las que interacciona destacan la enzima conjugadora de SUMO (SCE) y PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), un factor de procesividad de las polimerasas que coordina numerosos procesos implicados en el metabolismo del DNA. En la regulación de las funciones de PCNA cumple un papel fundamental la modificación postraduccional por SUMO y ubiquitina, ya que determina cómo el replisoma procesa los daños producidos en el DNA. En levaduras, la sumoilación de PCNA actúa reclutando a la helicasa Srs2, que reduce los eventos de recombinación indeseados durante la replicación. En este trabajo se ha demostrado que PCNA de tomate se sumoila en las lisinas 164 y 254, como se ha descrito en homólogos de otros organismos, y que la expresión de Rep interfiere con esta modificación. Como hipótesis principal, se ha planteado que la unión directa entre ambas proteínas es la responsable de la interferencia observada. Para corroborarla, se ha caracterizado SRS2 de Arabidopsis, que conserva la interacción con PCNA y SUMO

Migration of Type III Secretion System Transcriptional Regulators Links Gene Expression to Secretion

Many plant-pathogenic bacteria of considerable economic importance rely on type III secretion systems (T3SSs) of the Hrc-Hrp 1 family to subvert their plant hosts. T3SS gene expression is regulated through the HrpG and HrpV proteins, while secretion is controlled by the gatekeeper HrpJ. A link between the two mechanisms was so far unknown. Here, we show that a mechanistic coupling exists between the expression and secretion cascades through the direct binding of the HrpG/HrpV heterodimer, acting as a T3SS chaperone, to HrpJ. The ternary complex is docked to the cytoplasmic side of the inner bacterial membrane and orchestrates intermediate substrate secretion, without affecting early substrate secretion. The anchoring of the ternary complex to the membranes potentially keeps HrpG/HrpV away from DNA. In their multiple roles as transcriptional regulators and gatekeeper chaperones, HrpV/HrpG provide along with HrpJ potentially attractive targets for antibacterial strategies.On the basis of scientific/economic importance, Pseudomonas syringae and Erwinia amylovora are considered among the top 10 plant-pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Both employ type III secretion systems (T3SSs) of the Hrc-Hrp 1 family to subvert their plant hosts. For Hrc-Hrp 1, no functional link was known between the key processes of T3SS gene expression and secretion. Here, we show that a mechanistic coupling exists between expression and secretion cascades, through formation of a ternary complex involving the T3SS proteins HrpG, HrpV, and HrpJ. Our results highlight the functional and structural properties of a hitherto-unknown complex which orchestrates intermediate T3SS substrate secretion and may lead to better pathogen control through novel targets for antibacterial strategies

Geminivirus replication protein impairs sumo conjugation of PCNA at two acceptor sites

Geminiviruses are plant viruses with circular, single-stranded DNA (ssDNA) genomes that infect a broad range of plants causing substantial crop diseases worldwide. They replicate in nuclei of infected cells by using host DNA replication machinery and an essential protein encoded in their genome designated Rep (replication-associated protein). This multifunctional protein induces the accumulation of the host factors involved in replication and it is capable of interacting with a lot of plant proteins including PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), a processivity factor that coordinates a wide range of processes involved in maintenance, duplication and transmission of the genome, and the sumoylation enzyme that conjugates SUMO to target proteins (SUMO-conjugating enzyme- SCE). PCNA modification by SUMO, and also ubiquitin, has long been known to be of key importance for determining how DNA damage is processed by the replisome and for maintenance of overall genome integrity. In yeast, PCNA sumoylation has been associated to DNA repair involving homologous recombination (HR). Previously, we reported that Rep ectopic expression does not result in broad changes in the sumoylation pattern of plant cells, but it modifies the sumoylation state of selected host proteins. In this work, we show, using a reconstituted sumoylation system in Escherichia coli, that tomato PCNA is sumoylated at two residues, K254 and K164, and that co-expression of the Rep protein suppresses PCNA sumoylation at these lysines. Finally, we confirm that PCNA is sumoylated and that Rep also interferes with PCNA sumoylation in planta.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech