O Ligando Notch Delta4 na hematopoiese embrionária do ratinho

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2007The Notch pathway is highly conserved during evolution and exerts important roles in cellfate decisions and differentiation processes. Notch signaling has been shown to regulate postnatal hematopoiesis but its role in embryonic hematopoiesis is less clear. Primitive hematopoiesis takes place in the microvenvironments of the Yolk-sac and, later on, of the AGM. Using Embryoid Bodies (EBs) derived from murine embryonic stem cells (ESC), an in vitro system known to faithfully reproduce primitive hematopoiesis in the embryo we have observed that the expression of Delta4 (a Notch-ligand) is transiently upregulated in EB-cells at the beginning of primitive erythropoiesis (day4). Therefore, we attempted to investigate the functional consequences of deficiency of this ligand. For this we have made use of an ESC-line haploinsufficient for Delta4 (Delta4+/-). We observed in Delta4+/- EBs loss of transient up-regulation of Delta4 transcript, reduction of hemangioblast and multi-lineage hematopoietic potential, profound architectural abnormalities and evidence of epithelial-mesenchymal transition. Intriguingly, the expression of Notch target genes directly involved in hematopoiesis is similar in wild type and mutant EBs. Biochemical characterization of wild-type and mutant EBs at early days of development further revealed a vestigial presence of gamma-secretase-cleaved Notch1. These results show that Delta4 is a master regulator of primitive hematopoiesis, but in a manner that might be independent of the gamma-secretase-cleaved (canonical) Notch-ICD. To address this hypothesis a Delta4 mutant, devoid of 4 carboxy-terminal aminoacids, a region known to be involved in Delta4 functions independent of Notch. This construct will allow to investigate if the Delta4+/- EBs phenotype is due do Delta4 effects that are independent of Notch activationO sistema Notch é uma via de sinalizaçãoo evolutivamente conservada que desempenha um papel fundamental nos processos de diferenciação celular. Foi já demonstrada a sua função reguladora na hematopoiese pós-natal, mas conhece-se muito pouco do seu papel na hematopoiese embrionária. A hematopoiese embrionária ocorre nos microambientes do saco vitelino e, posteriormente, na AGM. Para investigar os efeitos do sistema Notch nos primeiros estadios da hematopoiese, usou-se um modelo in vitro de EBs diferenciados a partir de CEE, que reproduz fielmente a hematopoiese primitiva no embrião. Tendo-se observado um aumento transitório da transcrição do gene Delta4, um dos ligandos dos receptores Notch, no início da eritropoiese primitiva (dia 4), procurou-se averiguar as consequências funcionais da ausência deste ligando. Para tal, analisaram-se EBs derivados de uma linha haploinsuficiente para Delta4 (Delta4+/-). Observou-se que a perda de um alelo Delta4 conduz a alterações na dinâmica temporal de expressão Delta4 durante o desenvolvimento de EBs, à redução do seu potencial de geração de hemangioblastos e de linhagens hematopoidicas definitivas, a profundas alterações da estrutura tridimensional e a uma transição epitélio-mesenquima. Contudo, não se verificaram diferenças quantitativas na expressão de genes alvo do sistema Notch, envolvidos na hematopoiese. Por outro lado, a caracterização bioquímica de EBs controlo e mutantes nos primeiros dias de desenvolvimento, revelou uma presença vestigial de formas de Notch1 clivadas por gama-secretase. Estes resultados mostram que Delta4 é um regulador crónico da hematopoiese embrionária, mas que a sua acção se exerce por mecanismos independentes da sinalização canónica Notch, mediada por gama-secretase. Para investigar esta hipótese procedeu-se à construção de um mutante Delta4 desprovido de 4 aminoáidos da extremidade carboxi-terminal, região esta descrita como responsável po