Analyse des protéines du lait des Camélidés par approches protéomique et moléculaire

Milk is known to provide an excellent nutrition and protection against infection. It contains a range of soluble and cellular components which provide essential nutriments. Milks from different species differ significantly as to their protective proteins content which plays a role in the protection to the developing animal and/or human.In spite of their richness and their considerable production, dromedary and llama milks remain products relatively not much consumed and transformed because insufficiently studied and emphasized. The objective of this study was to investigate and compare the protein composition of the different fractions of llama and dromedary milk.Skimmed llama and dromedary milk proteins were first characterized by a two dimensional separation technique coupling Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography in the first dimension with sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis in the second dimension (RP-HPLC-SDS-PAGE). Milk proteins: caseins (αs1, αs2,β and κ caseins.) and some whey proteins like α-lactalbumin, lactoferin and serum albumin were identified using peptide mass fingerprinting.Llama and dromedary proteins milk were also characterized by on-line Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography/Electrospray Ionization Mass Spectrometry (LC-ESI-MS) analysis. This approach allowed attributing precise molecular masses for most of the previously MS-identified milk proteins.We reported also the successful use of the Two-Dimensional gel Electrophoresis (2-DE) tool to identify over 45 protein spots present in the dromedary whey milk. De novo sequencing of the llama α-lactalbumin protein by Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) showed the occurrence of two amino acid substitutions (R62L/I and K89L/I).Because in camelids, nothing is known about the milk fat globule membrane (MFGM), we used 1D-LC-MS/MS to identify 322 and 187 functional groups of proteins associated with dromedary and llama milk respectively.Le lait est connu par sa valeur nutritionnelle et son excellent pouvoir protecteur contre les infections. Il contient des composants solubles et cellulaires qui fournissent des nutriments essentiels. Les laits de différentes espèces diffèrent selon leur composition en protéines.Malgré leur richesse et leur production, les laits de dromadaire et du lama demeurent des produits relativement peu consommés et transformés car insuffisamment étudié et mis en valeur. L'objectif de cette étude était d’étudier et de comparer la composition en protéines des différentes fractions du lait du dromadaire et du lama.Les protéines du lait écrémé de dromadaire et de lama ont d'abord été caractérisées par une technique de séparation en deux dimensions couplée à la chromatographie liquide en phase liquide à haute performance en première dimension suivie de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en deuxième dimension (RP-HPLC -SDS- PAGE).Les protéines majeures du lait, les caséines αs1, αs2, β et κ ainsi que quelques protéines du lactosérum telles que l’α-lactalbumine, la lactoferrine et la sérum albumine ont été identifiées par carte d’empreinte peptidique.Les protéines du lait du lama et du dromadaire ont été aussi caractérisées par Chromatographie Liquide à Haute Performance en Phase inverse couplée à la Spectrométrie de Masse d’Ionisation Electrospray. Cette approche nous a permis d’attribuer les masses moléculaires précises pour la majorité des protéines identifiées précédemment par la spectrométrie de masse. De même, grâce à la technique d’électrophorèse bidimensionnelle sur gel (2-DE), nous avons pu identifier plus de 45 spots de protéines présentes dans le lactosérum du lait de dromadaire.Le séquençage de novo de l’α -lactalbumine du lama par la Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse en tandem (LC-MS/MS) a montré la présence de deux substitutions d'acides aminés ( R62L / I et K89L / I ).Puisque les données sur la membrane de globules gras du lait des Camélidés sont inexistantes , nous avons utilisé dans la dernière partie de ce travail l’outil 1D- LC-MS/MS qui a permis d'identifier 322 et 187 groupes fonctionnels de protéines associées à la membrane de globules gras du lait de dromadaire et du lama respectivement

Phosphoproteomics of the goat milk fat globule membrane: New insights into lipid droplet secretion from the mammary epithelial cell

Mechanisms of milk lipid secretion are highly controversial. Analyzing the fine protein composition of the “milk fat globule membrane” (MFGM), the triple-layered membrane surrounding milk lipid droplets (LDs) can provide mechanistic clues to better understand LD biosynthesis and secretion pathways in mammary epithelial cells (MECs). We therefore combined a high-sensitive Q-Exactive LC-MS/MS analysis of MFGM-derived peptides to the use of an in-house database intended to improve protein identification in the goat species. Using this approach, we performed the identification of 442 functional groups of proteins in the MFGM from goat milk. To get a more dynamic view of intracellular mechanisms driving LD dynamics in the MECs, we decided to investigate for the first time whether MFGM proteins were phosphorylated. MFGM proteins were sequentially digested by lysine-C and trypsin proteases and the resulting peptides were fractionated by a strong cation exchange chromatography. Titanium beads were used to enrich phosphopeptides from strong cation exchange chromatography eluted fractions. This approach lets us pinpoint 271 sites of phosphorylation on 124 unique goat MFGM proteins. Enriched GO terms associated with phosphorylated MFGM proteins were protein transport and actin cytoskeleton organization. Gained data are discussed with regard to lipid secretory mechanisms in the MECs. All MS data have been deposited in the ProteomeXchange with identifier PXD001039 (http://proteomecentral.proteomexchange.org/dataset/PXD001039)