10 research outputs found
ΠΡΠ΅Π½ΠΊΠ° ΠΊΠΎΠ»Π»Π°ΡΠ΅ΡΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΠΈ CRISPR/Cas13a-ΡΠΈΠ±ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ Π½Π° Π±ΠΈΠΎΠ°Π½Π°Π»ΠΈΠ·Π°ΡΠΎΡΠ΅ Agilent 2100
The paper describes an original technique for detecting the collateral activity of CRISPR/Cas 13a ribonuclease based on the assessment of ribosomal RNA degradation. The Agilent 2100 bioanalyzer is used as an analyzing device. This approach is an alternative to existing detection methods and has a number of advantages over them in the case when a quantitative assessment of activity is not required. On the example of the test sample, the optimal concentrations and ratios of the components of the reaction mixture, which are necessary to obtain the most indicative result, were determined. The proposed technique can be used for qualitative assessment of the activity of recombinant ribonuclease Cas13a preparations obtained under different conditions of heterologous protein expression and purification, as well as for testing guide RNAs.Π ΡΠ°Π±ΠΎΡΠ΅ ΠΎΠΏΠΈΡΡΠ²Π°Π΅ΡΡΡ ΠΎΡΠΈΠ³ΠΈΠ½Π°Π»ΡΠ½Π°Ρ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΈΠΊΠ° Π΄Π΅ΡΠ΅ΠΊΡΠΈΠΈ ΠΊΠΎΠ»Π»Π°ΡΠ΅ΡΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΠΈ CRISPR/Cas13a-ΡΠΈΠ±ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ, ΠΎΡΠ½ΠΎΠ²Π°Π½Π½Π°Ρ Π½Π° ΠΎΡΠ΅Π½ΠΊΠ΅ Π΄Π΅Π³ΡΠ°Π΄Π°ΡΠΈΠΈ ΡΠΈΠ±ΠΎΡΠΎΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ Π ΠΠ. Π ΠΊΠ°ΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ·ΠΈΡΡΡΡΠ΅Π³ΠΎ ΠΏΡΠΈΠ±ΠΎΡΠ° ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΡΠ΅ΡΡΡ Π±ΠΈΠΎΠ°Π½Π°Π»ΠΈΠ·Π°ΡΠΎΡ Agilent 2100. ΠΠ°Π½Π½ΡΠΉ ΠΏΠΎΠ΄Ρ
ΠΎΠ΄ ΡΠ²Π»ΡΠ΅ΡΡΡ Π°Π»ΡΡΠ΅ΡΠ½Π°ΡΠΈΠ²ΠΎΠΉ ΡΡΡΠ΅ΡΡΠ²ΡΡΡΠΈΠΌ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄Π°ΠΌ Π΄Π΅ΡΠ΅ΠΊΡΠΈΠΈ ΠΈ ΠΈΠΌΠ΅Π΅Ρ ΡΡΠ΄ ΠΏΡΠ΅ΠΈΠΌΡΡΠ΅ΡΡΠ² ΠΏΠΎ ΡΡΠ°Π²Π½Π΅Π½ΠΈΡ Ρ Π½ΠΈΠΌΠΈ Π² ΡΠΎΠΌ ΡΠ»ΡΡΠ°Π΅, ΠΊΠΎΠ³Π΄Π° Π½Π΅ ΡΡΠ΅Π±ΡΠ΅ΡΡΡ ΠΊΠΎΠ»ΠΈΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅Π½Π½Π°Ρ ΠΎΡΠ΅Π½ΠΊΠ° Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΠΈ. ΠΠ° ΠΏΡΠΈΠΌΠ΅ΡΠ΅ ΡΠ΅ΡΡΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΠ° ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»Π΅Π½Ρ ΠΎΠΏΡΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΡΠ΅ ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΠΈ ΠΈ ΡΠΎΠΎΡΠ½ΠΎΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΠΊΠΎΠΌΠΏΠΎΠ½Π΅Π½ΡΠΎΠ² ΡΠ΅Π°ΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠΉ ΡΠΌΠ΅ΡΠΈ, Π½Π΅ΠΎΠ±Ρ
ΠΎΠ΄ΠΈΠΌΡΠ΅ Π΄Π»Ρ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΡ Π½Π°ΠΈΠ±ΠΎΠ»Π΅Π΅ ΠΏΠΎΠΊΠ°Π·Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠ°. ΠΡΠ΅Π΄Π»Π°Π³Π°Π΅ΠΌΠ°Ρ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΈΠΊΠ° ΠΌΠΎΠΆΠ΅Ρ Π±ΡΡΡ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½Π° Π΄Π»Ρ ΠΊΠ°ΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΠΎΠΉ ΠΎΡΠ΅Π½ΠΊΠΈ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΠΈ ΠΏΡΠ΅ΠΏΠ°ΡΠ°ΡΠΎΠ² ΡΠ΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½ΡΠ½ΠΎΠΉ ΡΠΈΠ±ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ Cas13Π°, ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π½ΡΡ
ΠΏΡΠΈ ΡΠ°Π·Π½ΡΡ
ΡΡΠ»ΠΎΠ²ΠΈΡΡ
Π³Π΅ΡΠ΅ΡΠΎΠ»ΠΎΠ³ΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠΉ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ Π±Π΅Π»ΠΊΠ° ΠΈ Π΅Π³ΠΎ ΠΎΡΠΈΡΡΠΊΠΈ, Π° ΡΠ°ΠΊΠΆΠ΅ Π΄Π»Ρ ΡΠ΅ΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ Π½Π°ΠΏΡΠ°Π²Π»ΡΡΡΠΈΡ
Π ΠΠ
Π‘ΡΠ°Π½Π΄Π°ΡΡΠΈΠ·Π°ΡΠΈΡ ΠΏΡΠ΅ΠΏΠ°ΡΠ°ΡΠΎΠ² ΡΠ΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½ΡΠ½ΠΎΠΉ CRISPR/Cas13a-Π½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ Ρ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π ΠΠΠ°Π·Ρ Π Ρ ΠΈΠ·Π²Π΅ΡΡΠ½ΠΎΠΉ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΡΡ
The approach to characterize preparations of recombinant Cas13a-nuclease in terms of specific collateral activity has been proposed for standardization of enzyme preparations. The standardization of Cas13a preparations by the specific activity may benefit both the development of assays employing Cas13a collateral ribonuclease activity and the optimization of ribonuclease expression, purification, and storage. The approach is based on measurement of the initial rate of a cleavage of specially designed commercially available RNA molecules (βreportersβ labelled with a fluorophore and a quencher) by a preparation of recombinant Cas13a-nuclease and commercial RNase A of known activity. This requires the optimization of a molar ratio for the formation of Cas13a complexes with guide RNA as well as the optimization of amount of the RNA target. The use of a synthetic RNA target appears preferable compared with total RNA preparations.ΠΡΠ΅Π΄Π»ΠΎΠΆΠ΅Π½ ΠΏΠΎΠ΄Ρ
ΠΎΠ΄ ΠΊ Ρ
Π°ΡΠ°ΠΊΡΠ΅ΡΠΈΠ·Π°ΡΠΈΠΈ ΠΏΡΠ΅ΠΏΠ°ΡΠ°ΡΠΎΠ² ΡΠ΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½ΡΠ½ΠΎΠΉ Cas13a-Π½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ Π² ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°Ρ
ΡΠ΄Π΅Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠΎΠ»Π»Π°ΡΠ΅ΡΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΠΈ Π΄Π»Ρ ΠΈΡ
ΡΡΠ°Π½Π΄Π°ΡΡΠΈΠ·Π°ΡΠΈΠΈ. Π‘ΡΠ°Π½Π΄Π°ΡΡΠΈΠ·Π°ΡΠΈΡ ΠΏΡΠ΅ΠΏΠ°ΡΠ°ΡΠΎΠ² Cas13a-Π½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ ΠΏΠΎ ΡΠ΄Π΅Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΠΈ Π±ΡΠ΄Π΅Ρ ΠΏΠΎΠ»Π΅Π·Π½Π° ΠΊΠ°ΠΊ ΠΏΡΠΈ ΡΠ°Π·ΡΠ°Π±ΠΎΡΠΊΠ΅ ΡΠ΅ΡΡΠΎΠ², ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΡΡΡΠΈΡ
ΠΊΠΎΠ»Π»Π°ΡΠ΅ΡΠ°Π»ΡΠ½ΡΡ ΡΠΈΠ±ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Π½ΡΡ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΡ Cas13a, ΡΠ°ΠΊ ΠΈ Π΄Π»Ρ ΠΎΠΏΡΠΈΠΌΠΈΠ·Π°ΡΠΈΠΈ ΠΏΡΠΎΡΠ΅Π΄ΡΡ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ, ΠΎΡΠΈΡΡΠΊΠΈ ΠΈ Ρ
ΡΠ°Π½Π΅Π½ΠΈΡ ΡΠΈΠ±ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ. ΠΠΎΠ΄Ρ
ΠΎΠ΄ ΠΎΡΠ½ΠΎΠ²Π°Π½ Π½Π° ΠΈΠ·ΠΌΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠΈ Π½Π°ΡΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ ΡΠΊΠΎΡΠΎΡΡΠΈ ΡΠ°ΡΡΠ΅ΠΏΠ»Π΅Π½ΠΈΡ ΡΠΏΠ΅ΡΠΈΠ°Π»ΡΠ½ΠΎ ΡΠΎΠ·Π΄Π°Π½Π½ΡΡ
ΠΈ ΠΊΠΎΠΌΠΌΠ΅ΡΡΠ΅ΡΠΊΠΈ Π΄ΠΎΡΡΡΠΏΠ½ΡΡ
ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΠΎΠ² ΠΌΠΎΠ»Π΅ΠΊΡΠ» Π ΠΠ (FQ-ΡΠ΅ΠΏΠΎΡΡΠ΅ΡΠΎΠ², ΠΌΠ΅ΡΠ΅Π½Π½ΡΡ
ΡΠ»ΡΠΎΡΠΎΡΠΎΡΠΎΠΌ ΠΈ Ρ
ΠΈΠΌΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΠΌ ΡΠΎΠ΅Π΄ΠΈΠ½Π΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ β Π³Π°ΡΠΈΡΠ΅Π»Π΅ΠΌ ΡΠ»ΡΠΎΡΠ΅ΡΡΠ΅Π½ΡΠΈΠΈ) ΠΏΡΠ΅ΠΏΠ°ΡΠ°ΡΠΎΠΌ ΡΠ΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½ΡΠ½ΠΎΠΉ Cas13a-Π½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ ΠΈ ΠΊΠΎΠΌΠΌΠ΅ΡΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠΉ Π ΠΠΠ°Π·ΠΎΠΉ Π Ρ ΠΈΠ·Π²Π΅ΡΡΠ½ΠΎΠΉ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΡΡ. Π ΠΊΠ°ΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅ ΠΏΡΠ΅Π΄Π²Π°ΡΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΡΠ»ΠΎΠ²ΠΈΡ Π½Π΅ΠΎΠ±Ρ
ΠΎΠ΄ΠΈΠΌΠΎ Π½Π°ΠΉΡΠΈ ΠΎΠΏΡΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠ΅ ΠΌΠΎΠ»ΡΡΠ½ΠΎΠ΅ ΡΠΎΠΎΡΠ½ΠΎΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ Π΄Π»Ρ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΊΠΎΠΌΠΏΠ»Π΅ΠΊΡΠΎΠ² Cas13a Ρ Π½Π°ΠΏΡΠ°Π²Π»ΡΡΡΠ΅ΠΉ Π ΠΠ (Π½Π ΠΠ), Π° ΡΠ°ΠΊΠΆΠ΅ ΠΎΠΏΡΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠ΅ ΠΊΠΎΠ»ΠΈΡΠ΅ΡΡΠ²ΠΎ Π ΠΠ-ΠΌΠΈΡΠ΅Π½ΠΈ. ΠΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ ΡΠΈΠ½ΡΠ΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠΉ Π ΠΠ-ΠΌΠΈΡΠ΅Π½ΠΈ ΠΏΡΠ΅Π΄ΡΡΠ°Π²Π»ΡΠ΅ΡΡΡ ΠΏΡΠ΅Π΄ΠΏΠΎΡΡΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΡΠΌ ΠΏΠΎ ΡΡΠ°Π²Π½Π΅Π½ΠΈΡ Ρ ΠΏΡΠ΅ΠΏΠ°ΡΠ°ΡΠ°ΠΌΠΈ ΡΡΠΌΠΌΠ°ΡΠ½ΠΎΠΉ Π ΠΠ
ΠΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅ΡΠΎΠ² Ρ Π²ΡΡΠΎΠΊΠΎΠΉ ΡΡΠ΅ΠΏΠ΅Π½ΡΡ ΠΌΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ Π² ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Π½ΠΎΠΉ ΡΠ΅ΠΏΠ½ΠΎΠΉ ΡΠ΅Π°ΠΊΡΠΈΠΈ
The fluorescently-labeled DNA is widely used in various bioanalytical applications. For a number of applications, a high level of labeling could be beneficial. One of the ways to produce DNA fragments bearing multiple fluorescent tags is to use polymerase chain reaction (PCR) with primers heavily labeled with fluorophores. Here we tested how primers with multiple fluorescein tags perform in PCR. It has been found that the positioning of fluorescein tags at or near the 3β²-end upon primer multiple labeling can inhibit DNA amplification (up to a complete stop when tags are placed at the 3β²- or adjacent nucleotide). The mechanism, by which the presence of fluorescein tags at or near the primer 3β²-end affects the PCR performance, is rather ambiguous and can involve both a steric hindrance for polymerase binding from the fluorescein moiety, as well as destabilization of a primer-template duplex. Nonetheless, if multiple fluorescein tags are attached so that at least three nucleotides from the primer 3β²-end are unmodified, the production of DNA fragments bearing multiple fluorescein molecules is possible even if both primers are heavily labeled, though on the expense of amplicon yield.Π€Π»ΡΠΎΡΠ΅ΡΡΠ΅Π½ΡΠ½ΠΎ-ΠΌΠ΅ΡΠ΅Π½ΡΡ ΠΠΠ ΡΠΈΡΠΎΠΊΠΎ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΡΡΡ Π² ΡΠ°Π·Π»ΠΈΡΠ½ΡΡ
Π±ΠΈΠΎΠ°Π½Π°Π»ΠΈΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΡ
ΠΏΡΠΈΠ»ΠΎΠΆΠ΅Π½ΠΈΡΡ
. Π ΡΡΠ΄Π΅ ΡΠ»ΡΡΠ°Π΅Π² Π²ΡΡΠΎΠΊΠΈΠΉ ΡΡΠΎΠ²Π΅Π½Ρ ΠΌΠ΅ΡΠ΅Π½ΡΡ ΠΠΠ ΡΠ²Π»ΡΠ΅ΡΡΡ ΠΏΡΠ΅ΠΈΠΌΡΡΠ΅ΡΡΠ²ΠΎΠΌ. ΠΠ΄Π½ΠΈΠΌ ΠΈΠ· ΡΠΏΠΎΡΠΎΠ±ΠΎΠ² ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² ΠΠΠ, Π½Π΅ΡΡΡΠΈΡ
ΠΌΠ½ΠΎΠΆΠ΅ΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΡΠ΅ ΡΠ»ΡΠΎΡΠ΅ΡΡΠ΅Π½ΡΠ½ΡΠ΅ ΠΌΠ΅ΡΠΊΠΈ, ΡΠ²Π»ΡΠ΅ΡΡΡ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Π½ΠΎΠΉ ΡΠ΅ΠΏΠ½ΠΎΠΉ ΡΠ΅Π°ΠΊΡΠΈΠΈ (ΠΠ¦Π ) Ρ ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅ΡΠ°ΠΌΠΈ Ρ Π²ΡΡΠΎΠΊΠΎΠΉ ΡΡΠ΅ΠΏΠ΅Π½ΡΡ ΠΌΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ. Π Π΄Π°Π½Π½ΠΎΠΉ ΡΠ°Π±ΠΎΡΠ΅ ΠΌΡ ΠΈΡΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ, ΠΊΠ°ΠΊ ΠΏΡΠΈΡΡΡΡΡΠ²ΠΈΠ΅ ΠΌΠ½ΠΎΠ³ΠΎΡΠΈΡΠ»Π΅Π½Π½ΡΡ
ΠΌΠΎΠ»Π΅ΠΊΡΠ» ΡΠ»ΡΠΎΡΠ΅ΡΡΠ΅ΠΈΠ½Π°, ΠΏΡΠΈΠΊΡΠ΅ΠΏΠ»ΡΠ½Π½ΡΡ
ΠΊ ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅ΡΡ, Π²Π»ΠΈΡΠ΅Ρ Π½Π° ΡΠ΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°Ρ ΠΠ¦Π . ΠΡΠ»ΠΎ ΠΎΠ±Π½Π°ΡΡΠΆΠ΅Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ ΡΠ°ΡΠΏΠΎΠ»ΠΎΠΆΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΡΠ»ΡΠΎΡΠ΅ΡΡΠ΅ΠΈΠ½ΠΎΠ²ΠΎΠΉ ΠΌΠ΅ΡΠΊΠΈ Π½Π° 3β²-ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅ ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅ΡΠ° ΠΈΠ»ΠΈ Π²Π±Π»ΠΈΠ·ΠΈ Π½Π΅Π³ΠΎ ΠΌΠΎΠΆΠ΅Ρ ΠΈΠ½Π³ΠΈΠ±ΠΈΡΠΎΠ²Π°ΡΡ Π°ΠΌΠΏΠ»ΠΈΡΠΈΠΊΠ°ΡΠΈΡ (Π²ΠΏΠ»ΠΎΡΡ Π΄ΠΎ ΠΏΠΎΠ»Π½ΠΎΠΉ ΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ²ΠΊΠΈ, ΠΊΠΎΠ³Π΄Π° ΠΌΠ΅ΡΠΊΠ° Π½Π°Ρ
ΠΎΠ΄ΠΈΡΡΡ Π½Π΅ΠΏΠΎΡΡΠ΅Π΄ΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΠΎ Π½Π° 3β²-ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π²ΠΎΠΌ ΠΈΠ»ΠΈ ΡΠΎΡΠ΅Π΄Π½Π΅ΠΌ Ρ Π½ΠΈΠΌ Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π΅). ΠΠ΅Ρ
Π°Π½ΠΈΠ·ΠΌ, ΠΏΠΎΡΡΠ΅Π΄ΡΡΠ²ΠΎΠΌ ΠΊΠΎΡΠΎΡΠΎΠ³ΠΎ ΠΏΡΠΈΡΡΡΡΡΠ²ΠΈΠ΅ ΡΠ»ΡΠΎΡΠ΅ΡΡΠ΅ΠΈΠ½ΠΎΠ²ΡΡ
ΠΌΠ΅ΡΠΎΠΊ Π½Π° 3β-ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅ ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅ΡΠ° ΠΈΠ»ΠΈ Π²Π±Π»ΠΈΠ·ΠΈ Π½Π΅Π³ΠΎ Π²Π»ΠΈΡΠ΅Ρ Π½Π° ΡΡΡΠ΅ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΡ ΠΠ¦Π , Π΄ΠΎΠ²ΠΎΠ»ΡΠ½ΠΎ Π½Π΅ΠΎΠ΄Π½ΠΎΠ·Π½Π°ΡΠ΅Π½ ΠΈ ΠΌΠΎΠΆΠ΅Ρ Π²ΠΊΠ»ΡΡΠ°ΡΡ ΠΊΠ°ΠΊ ΡΡΠ΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠ΅ ΠΏΡΠ΅ΠΏΡΡΡΡΠ²ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ ΡΠ²ΡΠ·ΡΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ ΠΏΡΠΈΠΊΡΠ΅ΠΏΠ»ΡΠ½Π½ΠΎΠΉ ΠΌΠΎΠ»Π΅ΠΊΡΠ»ΠΎΠΉ ΡΠ»ΡΠΎΡΠ΅ΡΡΠ΅ΠΈΠ½Π°, ΡΠ°ΠΊ ΠΈ Π΄Π΅ΡΡΠ°Π±ΠΈΠ»ΠΈΠ·Π°ΡΠΈΡ Π΄ΡΠΏΠ»Π΅ΠΊΡΠ° ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅Ρ-ΠΌΠ°ΡΡΠΈΡΠ°. Π’Π΅ΠΌ Π½Π΅ ΠΌΠ΅Π½Π΅Π΅, Π΅ΡΠ»ΠΈ ΠΌΠ½ΠΎΠΆΠ΅ΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΡΠ΅ ΡΠ»ΡΠΎΡΠ΅ΡΡΠ΅ΠΈΠ½ΠΎΠ²ΡΠ΅ ΠΌΠ΅ΡΠΊΠΈ ΠΏΡΠΈΠΊΡΠ΅ΠΏΠ»Π΅Π½Ρ ΠΊ Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π°ΠΌ ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅ΡΠ° ΡΠ°ΠΊΠΈΠΌ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΠΎΠΌ, ΡΡΠΎ ΠΏΠΎ ΠΌΠ΅Π½ΡΡΠ΅ΠΉ ΠΌΠ΅ΡΠ΅ ΡΡΠΈ Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π° Ρ Π΅Π³ΠΎ 3β²-ΠΊΠΎΠ½ΡΠ° ΠΎΡΡΠ°ΡΡΡΡ Π½Π΅ΠΌΠΎΠ΄ΠΈΡΠΈΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΡΠΌΠΈ, ΡΠΎ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² ΠΠΠ Ρ Π²ΡΡΠΎΠΊΠΈΠΌ ΡΡΠΎΠ²Π½Π΅ΠΌ ΠΌΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ Π²ΠΎΠ·ΠΌΠΎΠΆΠ½ΠΎ Ρ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΡΡ ΠΠ¦Π , Ρ
ΠΎΡΡ ΠΈ Ρ Π·Π°ΠΌΠ΅ΡΠ½ΠΎ ΠΌΠ΅Π½ΡΡΠΈΠΌ Π²ΡΡ
ΠΎΠ΄ΠΎΠΌ, ΡΠ΅ΠΌ ΠΏΡΠΈ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠΈ Π½Π΅ΠΌΠΎΠ΄ΠΈΡΠΈΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΡΡ
ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅ΡΠΎΠ²
ΠΡΡΠΌΠ°Ρ Π΄Π΅ΡΠ΅ΠΊΡΠΈΡ ΠΌΠΈΠΊΡΠΎΠ ΠΠ mir-34a, -145 ΠΈ -218 Ρ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΡΡ CRISPR/Cas13a-Π½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ
Using CRISPR/Cas13a-nuclease we have demonstrated a feasibility of direct detection of three miRNAs, miR-34a, -145, and -218 (their molecular signature is suggested as a diagnostic and prognostic biomarker in cervical cancer),. The detection is based on registration of a cleavage of molecular reporters bearing a fluorophore and a quencher by the complex of CRISPR/Cas13a-nuclease and guide RNA (gRNA) with a spacer of 21-23 nucleotides long. The detection sensitivity varied among miRNAs tested by 10-fold, presumably due to the unwanted intramolecular partial base paring of gRNA. The miRNA detection with Cas13a nuclease strongly depended on the presence of background RNA thus potentially compromising its direct application to complex media in a general case. Further optimization of measurement conditions including probably an additional amplification of the signal generated by collateral activity of Cas13a nuclease is necessary to directly detect miR-34a, -145, and -218 in biological samples.ΠΠΎΠΊΠ°Π·Π°Π½Π° Π²ΠΎΠ·ΠΌΠΎΠΆΠ½ΠΎΡΡΡ ΠΏΡΡΠΌΠΎΠΉ Π΄Π΅ΡΠ΅ΠΊΡΠΈΠΈ ΡΡΠ΅Ρ
ΠΌΠΈΠΊΡΠΎΠ ΠΠ, miR-34a, -145 ΠΈ -218 (ΡΡΡ ΠΌΠΎΠ»Π΅ΠΊΡΠ»ΡΡΠ½Π°Ρ ΡΠΈΠ³Π½Π°ΡΡΡΠ° ΠΏΡΠ΅Π΄Π»Π°Π³Π°Π΅ΡΡΡ ΠΊΠ°ΠΊ Π΄ΠΈΠ°Π³Π½ΠΎΡΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΠΉ ΠΈ ΠΏΡΠΎΠ³Π½ΠΎΡΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΠΉ Π±ΠΈΠΎΠΌΠ°ΡΠΊΠ΅Ρ ΠΏΡΠΈ ΡΠ°ΠΊΠ΅ ΡΠ΅ΠΉΠΊΠΈ ΠΌΠ°ΡΠΊΠΈ), Ρ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΡΡ CRISPR/Cas13a-Π½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ. ΠΠ΅ΡΠ΅ΠΊΡΠΈΡ ΠΎΡΠ½ΠΎΠ²Π°Π½ΠΎ Π½Π° ΡΠ΅Π³ΠΈΡΡΡΠ°ΡΠΈΠΈ ΡΠ°ΡΡΠ΅ΠΏΠ»Π΅Π½ΠΈΡ ΠΌΠΎΠ»Π΅ΠΊΡΠ»ΡΡΠ½ΡΡ
Β«ΡΠ΅ΠΏΠΎΡΡΠ΅ΡΠΎΠ²Β» β ΠΊΠΎΡΠΎΡΠΊΠΈΡ
Π ΠΠ-ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄ΠΎΠ², Π½Π΅ΡΡΡΠΈΡ
ΡΠ»ΡΠΎΡΠΎΡΠΎΡ ΠΈ Π³Π°ΡΠΈΡΠ΅Π»Ρ β ΠΊΠΎΠΌΠΏΠ»Π΅ΠΊΡΠΎΠΌ CRISPR/Cas13a-Π½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ ΠΈ Π½Π°ΠΏΡΠ°Π²Π»ΡΡΡΠ΅ΠΉ Π ΠΠ (Π½Π ΠΠ) ΡΠΎ ΡΠΏΠ΅ΠΉΡΠ΅ΡΠΎΠΌ Π΄Π»ΠΈΠ½ΠΎΠΉ 21-23 Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π°. Π§ΡΠ²ΡΡΠ²ΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ ΠΎΠ±Π½Π°ΡΡΠΆΠ΅Π½ΠΈΡ Π²Π°ΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»Π° 10-ΠΊΡΠ°ΡΠ½ΠΎ ΡΡΠ΅Π΄ΠΈ ΡΠ΅ΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΡΡ
ΠΌΠΈΠΊΡΠΎΠ ΠΠ, ΠΏΡΠ΅Π΄ΠΏΠΎΠ»ΠΎΠΆΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎ ΠΈΠ·-Π·Π° Π½Π΅ΠΆΠ΅Π»Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ Π²Π½ΡΡΡΠΈΠΌΠΎΠ»Π΅ΠΊΡΠ»ΡΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠΈΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΏΠ°ΡΠΈΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΎΡΠ½ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠΉ Π½Π ΠΠ. ΠΠ±Π½Π°ΡΡΠΆΠ΅Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ Π΄Π΅ΡΠ΅ΠΊΡΠΈΡ ΠΌΠΈΠΊΡΠΎΠ ΠΠ Ρ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΡΡ Π½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ Cas13a ΡΠΈΠ»ΡΠ½ΠΎ Π·Π°Π²ΠΈΡΠΈΡ ΠΎΡ ΠΏΡΠΈΡΡΡΡΡΠ²ΠΈΡ ΡΠΎΠ½ΠΎΠ²ΠΎΠΉ Π ΠΠ, ΡΡΠΎ Π² ΠΎΠ±ΡΠ΅ΠΌ ΡΠ»ΡΡΠ°Π΅ ΠΌΠΎΠΆΠ΅Ρ Π·Π°ΡΡΡΠ΄Π½ΠΈΡΡ ΡΠ°ΠΊΡΡ Π΄Π΅ΡΠ΅ΠΊΡΠΈΡ Π² ΡΠ»ΠΎΠΆΠ½ΠΎΠΌ ΠΌΠ°ΡΡΠΈΠΊΡΠ΅. ΠΠ°Π»ΡΠ½Π΅ΠΉΡΠ°Ρ ΠΎΠΏΡΠΈΠΌΠΈΠ·Π°ΡΠΈΡ ΡΡΠ»ΠΎΠ²ΠΈΠΉ ΠΈΠ·ΠΌΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ, Π²ΠΊΠ»ΡΡΠ°Ρ, Π²Π΅ΡΠΎΡΡΠ½ΠΎ, Π΄ΠΎΠΏΠΎΠ»Π½ΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΠ΅ ΡΡΠΈΠ»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΡΠΈΠ³Π½Π°Π»Π°, Π³Π΅Π½Π΅ΡΠΈΡΡΠ΅ΠΌΠΎΠ³ΠΎ ΠΊΠΎΠ»Π»Π°ΡΠ΅ΡΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΡΡ Π½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ Cas13a, Π½Π΅ΠΎΠ±Ρ
ΠΎΠ΄ΠΈΠΌΠ° Π΄Π»Ρ ΠΏΡΡΠΌΠΎΠΉ Π΄Π΅ΡΠ΅ΠΊΡΠΈΠΈ miR-34a, -145 ΠΈ -218 Π² Π±ΠΈΠΎΠ»ΠΎΠ³ΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΡ
ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΠ°Ρ
ΠΠ΄Π΅Π½ΡΠΈΡΠΈΠΊΠ°ΡΠΈΡ ΡΠΈΠ±ΠΎΡΠΎΠΌΠ½ΡΡ ΡΡΡΠΏΡΠΈΠ½ΡΠΎΠ² Π½Π° ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠΌ Π³Π΅Π»Π΅ ΠΏΡΠΈ ΠΏΡΠΎΡΠΈΠ»ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠΈ ΡΡΠ°Π½ΡΠ»Π°ΡΠΎΠΌΠ°: ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ ΠΠΠ-ΠΌΠ°ΡΠΊΡΡΠΎΠ²
The commercial DNA ladder was tested as a substitute for RNA size standards to identify ribosomal footprints (RNA fragments of about 30 nucleotides long) on an electrophoretic polyacrylamide gel for the purposes of translatome profiling. It has been found that 25 and 35 nucleotides long synthetic RNA oligonucleotides do migrate slower than the synthetic DNA oligonucleotides of the matching length and sequences and their positions on the gel coincide with those of 30 and 40 nucleotides long DNA oligonucleotides, correspondingly, of the commercial IDT 20/100 DNA oligo length standards. By using this DNA ladder and RNA isolated from the preparation enriched in ribosomes (obtained by fractionating on MicroSpin S-400 columns the HepG2 cell lysate treated with RNase I), the position of a band of putative ribosomal footprints can be identified on a gel that has been verified by measuring in an RNA-seq experiment the length of RNA fragments extracted from the band.ΠΠΎΠΌΠΌΠ΅ΡΡΠ΅ΡΠΊΠΈΠ΅ ΠΠΠ-ΠΌΠ°ΡΠΊΡΡΡ ΡΠ΅ΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΊΠ°ΠΊ Π·Π°ΠΌΠ΅Π½Ρ Π ΠΠ-ΡΡΠ°Π½Π΄Π°ΡΡΠΎΠ² Π΄Π»ΠΈΠ½Ρ ΠΌΠΎΠ»Π΅ΠΊΡΠ»Ρ Π΄Π»Ρ ΠΈΠ΄Π΅Π½ΡΠΈΡΠΈΠΊΠ°ΡΠΈΠΈ ΡΠΈΠ±ΠΎΡΠΎΠΌΠ½ΡΡ
ΡΡΡΠΏΡΠΈΠ½ΡΠΎΠ² (ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² Π ΠΠ Π΄Π»ΠΈΠ½ΠΎΠΉ ΠΎΠΊΠΎΠ»ΠΎ 30 Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄ΠΎΠ²) Π½Π° ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠΌ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΌ Π³Π΅Π»Π΅ ΠΏΡΠΈ ΠΏΡΠΎΡΠΈΠ»ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠΈ ΡΡΠ°Π½ΡΠ»Π°ΡΠΎΠΌΠ°. ΠΡΠ»ΠΎ ΠΎΠ±Π½Π°ΡΡΠΆΠ΅Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ ΡΠΈΠ½ΡΠ΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΠ΅ Π ΠΠ-ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Ρ Π΄Π»ΠΈΠ½ΠΎΠΉ 25 ΠΈ 35 Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄ΠΎΠ² ΠΌΠΈΠ³ΡΠΈΡΡΡΡ ΠΌΠ΅Π΄Π»Π΅Π½Π½Π΅Π΅, ΡΠ΅ΠΌ ΡΠΈΠ½ΡΠ΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΠ΅ ΠΠΠ-ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Ρ ΡΠΎΠΎΡΠ²Π΅ΡΡΡΠ²ΡΡΡΠ΅ΠΉ Π΄Π»ΠΈΠ½Ρ ΠΈ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠ΅ΠΉ, ΠΈ ΠΈΡ
ΠΏΠΎΠ»ΠΎΠΆΠ΅Π½ΠΈΠ΅ Π½Π° Π³Π΅Π»Π΅ ΡΠΎΠ²ΠΏΠ°Π΄Π°Π΅Ρ Ρ ΠΏΠΎΠ»ΠΎΠΆΠ΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΠΠΠ- ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄ΠΎΠ² Π΄Π»ΠΈΠ½ΠΎΠΉ 30 ΠΈ 40 Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄ΠΎΠ² ΡΠΎΠΎΡΠ²Π΅ΡΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΠΎ ΠΈΠ· ΠΊΠΎΠΌΠΌΠ΅ΡΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠ³ΠΎ Π½Π°Π±ΠΎΡΠ° ΡΡΠ°Π½Π΄Π°ΡΡΠΎΠ² Π΄Π»ΠΈΠ½ ΠΠΠ-ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄ΠΎΠ² Β«IDT 20/100 DNA oligo length standardsΒ». ΠΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΡΡ Π΄Π°Π½Π½ΡΠΉ Π½Π°Π±ΠΎΡ ΠΈ Π ΠΠ, Π²ΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½Π½ΡΡ ΠΈΠ· ΠΏΡΠ΅ΠΏΠ°ΡΠ°ΡΠ°, ΠΎΠ±ΠΎΠ³Π°ΡΠ΅Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΈΠ±ΠΎΡΠΎΠΌΠ°ΠΌΠΈ (ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΡΠ°ΠΊΡΠΈΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π½Π° ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΠ°Ρ
MicroSpin S-400 ΠΊΠ»Π΅ΡΠΎΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ Π»ΠΈΠ·Π°ΡΠ° HepG2, ΠΎΠ±ΡΠ°Π±ΠΎΡΠ°Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π ΠΠΠ°Π·ΠΎΠΉ I), ΠΌΠΎΠΆΠ½ΠΎ ΠΈΠ΄Π΅Π½ΡΠΈΡΠΈΡΠΈΡΠΎΠ²Π°ΡΡ ΠΏΠΎΠ»ΠΎΠΆΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΠΎΠ»ΠΎΡΡ ΠΏΡΠ΅Π΄ΠΏΠΎΠ»Π°Π³Π°Π΅ΠΌΡΡ
ΡΠΈΠ±ΠΎΡΠΎΠΌΠ½ΡΡ
ΡΡΡΠΏΡΠΈΠ½ΡΠΎΠ² Π½Π° Π³Π΅Π»Π΅, ΡΡΠΎ Π±ΡΠ»ΠΎ ΠΏΠΎΠ΄ΡΠ²Π΅ΡΠΆΠ΄Π΅Π½ΠΎ ΠΈΠ·ΠΌΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π΄Π»ΠΈΠ½Ρ ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² Π ΠΠ, Π²ΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½Π½ΡΡ
ΠΈΠ· ΠΏΠΎΠ»ΠΎΡΡ, ΠΏΡΠΈ ΠΏΡΠΎΠ²Π΅Π΄Π΅Π½ΠΈΠΈ ΠΈΡ
ΡΠ΅ΠΊΠ²Π΅Π½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΎΠΌ RNA-seq
ΠΠ΅Π½Ρ Β«ΡΡΠ°Ρ Π°Π½ΠΎΠ²ΡΡΒ» 18 Ρ ΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΠΌΡ ΡΠ΅Π»ΠΎΠ²Π΅ΠΊΠ°, ΠΎΡΡΡΡΡΡΠ²ΡΡΡΠΈΠ΅ Π±Π΅Π»ΠΊΠΈ ΠΈ Π½Π΅ ΠΎΡ Π°ΡΠ°ΠΊΡΠ΅ΡΠΈΠ·ΠΎΠ²Π°Π½Π½ΡΠ΅ Π±Π΅Π»ΠΊΠΈ Π² ΡΠΊΠ°Π½ΠΈ ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈ ΠΈ ΠΊΠ»Π΅ΡΠΎΡΠ½ΠΎΠΉ Π»ΠΈΠ½ΠΈΠΈ HepG2
Missing (MP) and functionally uncharacterized proteins (uPE1) comprise less than 5% of the total number of proteins encoded by human Chr18 genes. Within half a year, since the January 2020 version of NextProt, the number of entries in the MP+uPE1 datasets changed, mainly due to the achievements of antibody-based proteomics. Assuming that the proteome is closely related to the transcriptome scaffold, quantitative PCR, Illumina HiSeq, and Oxford Nanopore Technology were applied to characterize the liver samples of three male donors in comparison with the HepG2 cell line. The data mining of the Expression Atlas (EMBL-EBI) and the profiling of biopsy samples by using orthogonal methods of transcriptome analysis have shown that in HepG2 cells and the liver, the genes encoding functionally uncharacterized proteins (uPE1) are expressed as low as for the missing proteins (less than 1 copy per cell), except the selected cases of HSBP1L1, TMEM241, C18orf21, and KLHL14. The initial expectation that uPE1 genes might be expressed at higher levels than MP genes, was compromised by severe discrepancies in our semi-quantitative gene expression data and in public databanks. Such discrepancy forced us to revisit the transcriptome of Chr18, the target of the Russian C-HPP Consortium. Tanglegram of highly expressed genes and further correlation analysis have shown the severe dependencies on the mRNA extraction method and the analytical platform. Targeted gene expression analysis by quantitative PCR (qPCR) and high-throughput transcriptome profiling (Illumina HiSeq and ONT MinION) for the same set of samples from normal liver tissue and HepG2 cells revealed the detectable expression of 250+ (92%) protein-coding genes of Chr18 (at least one method). The expression of slightly more than 50% protein-coding genes was detected simultaneously by all three methods. Correlation analysis of the gene expression profiles showed that the grouping of the datasets depended almost equally on both the type of biological material and the experimental method, particularly cDNA/mRNA isolation and library preparation.ΠΡΡΡΡΡΡΠ²ΡΡΡΠΈΠ΅ Π±Π΅Π»ΠΊΠΈ ΠΈ ΡΡΠ½ΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π°Π»ΡΠ½ΠΎ Π½Π΅ ΠΎΡ
Π°ΡΠ°ΠΊΡΠ΅ΡΠΈΠ·ΠΎΠ²Π°Π½Π½ΡΠ΅ Π±Π΅Π»ΠΊΠΈ (Π² Π°Π½Π³Π»ΠΎΡΠ·ΡΡΠ½ΠΎΠΉ Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠ°ΡΡΡΠ΅ ΠΎΠ±ΠΎΠ·Π½Π°ΡΠ΅Π½Π½ΡΠ΅ ΠΊΠ°ΠΊ missing (MP) ΠΈ functionally uncharacterized proteins (uPE1), ΡΠΎΠΎΡΠ²Π΅ΡΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΠΎ) ΡΠΎΡΡΠ°Π²Π»ΡΡΡ ΠΌΠ΅Π½Π΅Π΅ 5% ΠΎΡ ΠΎΠ±ΡΠ΅Π³ΠΎ ΡΠΈΡΠ»Π° Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ², ΠΊΠΎΠ΄ΠΈΡΡΠ΅ΠΌΡΡ
Π³Π΅Π½Π°ΠΌΠΈ 18 Ρ
ΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΠΌΡ ΡΠ΅Π»ΠΎΠ²Π΅ΠΊΠ°. Π ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΠΎΠ»ΡΠ³ΠΎΠ΄Π°, Π½Π°ΡΠΈΠ½Π°Ρ Ρ ΡΠ½Π²Π°ΡΡ 2020 Π³ΠΎΠ΄Π°, Π² Π²Π΅ΡΡΠΈΠΈ NextProt Π²ΡΡΠΎΡΠ»ΠΎ ΠΊΠΎΠ»ΠΈΡΠ΅ΡΡΠ²ΠΎ Π·Π°ΠΏΠΈΡΠ΅ΠΉ Π² Π½Π°Π±ΠΎΡΠ°Ρ
Π΄Π°Π½Π½ΡΡ
MP+uPE1. ΠΠΎΠ΄ΠΎΠ±Π½ΡΠ΅ ΠΈΠ·ΠΌΠ΅Π½Π΅Π½ΠΈΡ ΠΎΠ±ΡΡΠ»ΠΎΠ²Π»Π΅Π½Ρ ΠΏΡΠ΅ΠΈΠΌΡΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΠΎ Π΄ΠΎΡΡΠΈΠΆΠ΅Π½ΠΈΡΠΌΠΈ ΠΏΡΠΎΡΠ΅ΠΎΠΌΠΈΠΊΠΈ Π½Π° ΠΎΡΠ½ΠΎΠ²Π΅ Π°Π½ΡΠΈΡΠ΅Π». Π Π΄Π°Π½Π½ΠΎΠΉ ΡΠ°Π±ΠΎΡΠ΅ ΠΊΠΎΠ»ΠΈΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅Π½Π½Π°Ρ ΠΠ¦Π , ΡΠ΅Ρ
Π½ΠΎΠ»ΠΎΠ³ΠΈΠΈ ΡΠ΅ΠΊΠ²Π΅Π½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ Illumina HiSeq ΠΈ Oxford Nanopore Technologies Π±ΡΠ»ΠΈ ΠΏΡΠΈΠΌΠ΅Π½Π΅Π½Ρ Π΄Π»Ρ ΡΡΠ°Π²Π½ΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ·Π° ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΎΠΌΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΠΏΡΠΎΡΠΈΠ»Ρ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΠΎΠ² ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈ ΡΡΠ΅Ρ
Π΄ΠΎΠ½ΠΎΡΠΎΠ² ΠΌΡΠΆΡΠΊΠΎΠ³ΠΎ ΠΏΠΎΠ»Π° ΠΈ ΠΊΠ»Π΅ΡΠΎΡΠ½ΠΎΠΉ Π»ΠΈΠ½ΠΈΠΈ HepG2. ΠΠ½Π°Π»ΠΈΠ· Π΄Π°Π½Π½ΡΡ
Π°ΡΠ»Π°ΡΠ° ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ (Expression Atlas, EMBL-EBI) ΠΈ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π½ΡΡ
ΡΠ΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠΎΠ² ΠΏΠΎ Π±ΠΈΠΎΠ»ΠΎΠ³ΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΠΌ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΠ°ΠΌ Ρ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΠΎΡΡΠΎΠ³ΠΎΠ½Π°Π»ΡΠ½ΡΡ
ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΎΠ² Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ·Π° ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΎΠΌΠ° ΠΏΠΎΠΊΠ°Π·Π°Π», ΡΡΠΎ Π² ΠΊΠ»Π΅ΡΠΊΠ°Ρ
ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈ ΠΈ HepG2 ΡΡΠΎΠ²Π΅Π½Ρ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ Π³Π΅Π½ΠΎΠ², ΠΊΠΎΠ΄ΠΈΡΡΡΡΠΈΡ
ΡΡΠ½ΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π°Π»ΡΠ½ΠΎ Π½Π΅ ΠΎΡ
Π°ΡΠ°ΠΊΡΠ΅ΡΠΈΠ·ΠΎΠ²Π°Π½Π½ΡΠ΅ Π±Π΅Π»ΠΊΠΈ (uPE1), Π½Π°Ρ
ΠΎΠ΄ΠΈΡΡΡ Π½Π° ΡΠ°ΠΊΠΎΠΌ ΠΆΠ΅ Π½ΠΈΠ·ΠΊΠΎΠΌ ΡΡΠΎΠ²Π½Π΅, ΠΊΠ°ΠΊ ΠΈ Π² ΡΠ»ΡΡΠ°Π΅ Π³Π΅Π½ΠΎΠ² MP (Π² ΠΊΠΎΠ»ΠΈΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅ ΠΌΠ΅Π½Π΅Π΅ 1 ΠΊΠΎΠΏΠΈΠΈ Π½Π° ΠΊΠ»Π΅ΡΠΊΡ). ΠΡΠΊΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΡΠΎΡΡΠ°Π²ΠΈΠ»ΠΈ Π½Π΅ΡΠΊΠΎΠ»ΡΠΊΠΎ Π³Π΅Π½ΠΎΠ²: HSBP1L1, TMEM241, C18orf21 ΠΈ KLHL14. Π‘ΠΎΠ³Π»Π°ΡΠ½ΠΎ ΡΡΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΡΠΌ ΡΠ°ΡΡ
ΠΎΠΆΠ΄Π΅Π½ΠΈΡΠΌ Π² ΡΠ°Π½Π΅Π΅ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π½ΡΡ
ΠΏΠΎΠ»ΡΠΊΠΎΠ»ΠΈΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΡΡ
Π΄Π°Π½Π½ΡΡ
ΠΏΠΎ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ Π³Π΅Π½ΠΎΠ² ΠΈ Π΄Π°Π½Π½ΡΠΌ Π² ΠΎΡΠΊΡΡΡΡΡ
Π±Π°Π·Π°Ρ
Π΄Π°Π½Π½ΡΡ
, ΠΈΠ·Π½Π°ΡΠ°Π»ΡΠ½ΠΎ ΠΏΡΠ΅Π΄ΠΏΠΎΠ»Π°Π³Π°Π»ΠΎΡΡ, ΡΡΠΎ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΡ Π³Π΅Π½ΠΎΠ² uPE1 ΠΌΠΎΠΆΠ΅Ρ Π±ΡΡΡ Π²ΡΡΠ΅, ΡΠ΅ΠΌ Π³Π΅Π½ΠΎΠ² MP. ΠΠΎΠ΄ΠΎΠ±Π½ΠΎΠ΅ ΡΠ°ΡΡ
ΠΎΠΆΠ΄Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΠΎΠ±ΡΠ΄ΠΈΠ»ΠΎ ΠΎΠ±ΡΠ°ΡΠΈΡΡΡΡ ΠΊ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΎΠΌΡ 18 Ρ
ΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΠΌΡ ΡΠ΅Π»ΠΎΠ²Π΅ΠΊΠ°, ΡΠ²Π»ΡΡΡΠ΅ΠΉΡΡ ΡΠ΅Π»Π΅Π²ΠΎΠΉ Π΄Π»Ρ Π ΠΎΡΡΠΈΠΈ Π² ΠΏΡΠΎΠ΅ΠΊΡΠ΅ Β«ΠΡΠΎΡΠ΅ΠΎΠΌ ΡΠ΅Π»ΠΎΠ²Π΅ΠΊΠ°Β». ΠΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π½ΡΠ΅ ΡΠ΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΡ ΠΎ Π½Π°ΠΈΠ±ΠΎΠ»Π΅Π΅ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΡΡΠ΅ΠΌΡΡ
Π³Π΅Π½Π°Ρ
ΠΈ Π΄Π°Π»ΡΠ½Π΅ΠΉΡΠΈΠΉ ΠΊΠΎΡΡΠ΅Π»ΡΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΠΉ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ· ΠΏΠΎΠΊΠ°Π·Π°Π» ΡΡΡΠ΅ΡΡΠ²ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ Π·Π°Π²ΠΈΡΠΈΠΌΠΎΡΡΠΈ ΠΎΡ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄Π° ΡΠΊΡΡΡΠ°ΠΊΡΠΈΠΈ ΠΌΠ ΠΠ ΠΈ Π°Π½Π°Π»ΠΈΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠΉ ΠΏΠ»Π°ΡΡΠΎΡΠΌΡ. ΠΠ½Π°Π»ΠΈΠ· ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ ΡΠ΅Π»Π΅Π²ΡΡ
Π³Π΅Π½ΠΎΠ² 18 Ρ
ΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΠΌΡ Ρ ΠΏΡΠΈΠΌΠ΅Π½Π΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΠΊΠΎΠ»ΠΈΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΠΎΠΉ ΠΠ¦Π (qPCR) ΠΈ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΎΠ² Π²ΡΡΠΎΠΊΠΎΠΏΡΠΎΠΈΠ·Π²ΠΎΠ΄ΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΠΏΡΠΎΡΠΈΠ»ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΎΠΌΠ° (Illumina HiSeq ΠΈ ONT MinION) Π΄Π»Ρ ΠΎΠ΄ΠΈΠ½Π°ΠΊΠΎΠ²ΡΡ
Π½Π°Π±ΠΎΡΠΎΠ² ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΠΎΠ² Π½ΠΎΡΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ ΡΠΊΠ°Π½ΠΈ ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈ ΠΈ ΠΊΠ»Π΅ΡΠΎΡΠ½ΠΎΠΉ Π»ΠΈΠ½ΠΈΠΈ HepG2 Π²ΡΡΠ²ΠΈΠ» Π±ΠΎΠ»Π΅Π΅ 250 (92%) Π±Π΅Π»ΠΎΠΊ-ΠΊΠΎΠ΄ΠΈΡΡΡΡΠΈΡ
Π³Π΅Π½ΠΎΠ², Π΄Π΅ΡΠ΅ΠΊΡΠΈΡΡΠ΅ΠΌΡΡ
Ρ
ΠΎΡΡ Π±Ρ ΠΎΠ΄Π½ΠΈΠΌ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΎΠΌ. ΠΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΡ Π±ΠΎΠ»Π΅Π΅ ΡΠ΅ΠΌ 50% Π±Π΅Π»ΠΎΠΊ-ΠΊΠΎΠ΄ΠΈΡΡΡΡΠΈΡ
Π³Π΅Π½ΠΎΠ² Π±ΡΠ»Π° Π΄Π΅ΡΠ΅ΠΊΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π° Π²ΡΠ΅ΠΌΠΈ ΡΡΠ΅ΠΌΡ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄Π°ΠΌΠΈ. ΠΠΎΡΡΠ΅Π»ΡΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΠΉ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ· ΠΏΡΠΎΡΠΈΠ»Π΅ΠΉ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ Π³Π΅Π½ΠΎΠ² ΠΏΠΎΠΊΠ°Π·Π°Π», ΡΡΠΎ ΡΠ΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΡ Β«Π³ΡΡΠΏΠΏΠΈΡΡΡΡΡΡΒ» Π² Π·Π°Π²ΠΈΡΠΈΠΌΠΎΡΡΠΈ ΠΎΡ ΡΠΈΠΏΠ° Π±ΠΈΠΎΠ»ΠΎΠ³ΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠ³ΠΎ ΠΌΠ°ΡΠ΅ΡΠΈΠ°Π»Π° ΠΈ ΡΠΊΡΠΏΠ΅ΡΠΈΠΌΠ΅Π½ΡΠ°Π»ΡΠ½ΡΡ
ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΎΠ², Π² ΡΠ°ΡΡΠ½ΠΎΡΡΠΈ ΠΎΡ ΡΠΏΠΎΡΠΎΠ±Π° ΠΏΠΎΠ΄Π³ΠΎΡΠΎΠ²ΠΊΠΈ Π±ΠΈΠ±Π»ΠΈΠΎΡΠ΅ΠΊΠΈ (Π²ΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΠΊΠΠΠ, ΠΌΠ ΠΠ). ΠΠ°Π²ΠΈΡΠΈΠΌΠΎΡΡΡ ΠΎΡ Π²ΡΠ±ΠΎΡΠ° ΡΠΏΠΎΡΠΎΠ±Π° Π±ΠΈΠΎΠΈΠ½ΡΠΎΡΠΌΠ°ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠΉ ΠΎΠ±ΡΠ°Π±ΠΎΡΠΊΠΈ Π±ΡΠ»Π° ΠΎΡΠΌΠ΅ΡΠ΅Π½Π° Π² Π·Π½Π°ΡΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎ ΠΌΠ΅Π½ΡΡΠ΅ΠΉ ΡΡΠ΅ΠΏΠ΅Π½ΠΈ