Isolation of a Glucosamine Binding Leguminous Lectin with Mitogenic Activity towards Splenocytes and Anti-Proliferative Activity towards Tumor Cells

A dimeric 64-kDa glucosamine-specific lectin was purified from seeds of Phaseolus vulgaris cv. “brown kidney bean.” The simple 2-step purification protocol involved affinity chromatography on Affi-gel blue gel and gel filtration by FPLC on Superdex 75. The lectin was absorbed on Affi-gel blue gel and desorbed using 1M NaCl in the starting buffer. Gel filtration on Superdex 75 yielded a major absorbance peak that gave a single 32-kDa band in SDS-PAGE. Hemagglutinating activity was completely preserved when the ambient temperature was in the range of 20°C–60°C. However, drastic reduction of the activity occurred at temperatures above 65°C. Full hemagglutinating activity of the lectin was observed at an ambient pH of 3 to 12. About 50% activity remained at pH 0–2, and only residual activity was observed at pH 13–14. Hemagglutinating activity of the lectin was inhibited by glucosamine. The brown kidney bean lectin elicited maximum mitogenic activity toward murine splenocytes at 2.5 µM. The mitogenic activity was nearly completely eliminated in the presence of 250 mM glucosamine. The lectin also increased mRNA expression of the cytokines IL-2, TNF-α and IFN-γ. The lectin exhibited antiproliferative activity toward human breast cancer (MCF7) cells, hepatoma (HepG2) cells and nasopharyngeal carcinoma (CNE1 and CNE2) cells with IC50 of 5.12 µM, 32.85 µM, 3.12 µM and 40.12 µM respectively after treatment for 24 hours. Flow cytometry with Annexin V and propidum iodide staining indicated apoptosis of MCF7 cells. Hoechst 33342 staining also indicated formation of apoptotic bodies in MCF7 cells after exposure to brown kidney bean lectin. Western blotting revealed that the lectin-induced apoptosis involved ER stress and unfolded protein response

ДНК-ДИАГНОСТИКА АНАПЛАЗМОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Objective of research: The purpose of our research was to develop a DNA diagnostic method for anaplasmosis in cattle. Materials and methods: Blood samples were obtained from the tail vein with the use of ethylenediaminetetraacetic acid as an anticoagulant. The extraction of DNA was performed with the kit Sorb-M. To analyze the gene msp4 the following sequences belonging to different isolates Anaplasma marginale were used. To select primers the conserved elements of sequences were detected with the server СlustalW2. The specificity of primers was checked by a BLASTN search. The results of polymerase chain reaction (PCR) were estimated using 2% agarose gel electrophoresis. Electrophoresis was performed within 40 minutes at the field intensity 5 V/cm. Fragments of gene msp4 obtained as a results of polymerase chain reaction (PCR) were purified, ligated and cloned in E. coli cells. Transformation was performed using the heat shock method. Search for E. coli colonies containing pGEM-msp4 plasmid was conducted by the PCR method using standard M13 primers with the following analysis of PCR results by electrophoresis. Target colonies of E. coli were cultured overnight at 37 °С in 2 ml LB medium containing ampicillin in a 100 mcg /ml concentration. Sequencing of received plasmids pGEM-msp4 was carried out by Sanger method and the genetic analyzer Applied Biosystems 3130.  Results and discussion: Development and approbation of primers on the basis of the MSP4 gene of Anaplasma marginale to perform DNA diagnostics of anaplasmosis in cattle by PCR method were described. Due to PCR sensitivity along with the use of primers, it is possible to identify 100 and more gene copies. TheЦель исследования – разработка метода ДНК-диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота.  Материалы и методы. Пробы крови отбирали из хвостовой вены с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта. ДНК выделяли с помощью набора Sorb-M. Для анализа гена msp4 были использованы соответствующие последовательности, принадлежащие разным изолятам Anaplasma marginale. Выявление консервативных участков последовательностей для подбора праймеров проводили с помощью сервера СlustalW2. Видоспецифичность праймеров проверяли с использованием алгоритма BLASTN. Результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) оценивали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Электрофорез проводили в течение 40 минут при напряженности поля 5 В/см. Полученные в результате ПЦР фрагменты гена msp4 были очищены, лигированы и клонированы в клетках E. coli. Трансформацию проводили методом теплового шока. Поиск колоний E. coli DH5α, содержащих плазмиду pGEM-msp4, проводили методом ПЦР с использованием стандартных праймеров M13 с последующим анализом результатов ПЦР методом электрофореза. Целевые колонии наращивали в течение ночи при 37 °С в 2 мл среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Секвенирование полученных плазмид pGEM-msp4 осуществляли по методу Сэнгера и генетического анализатора Applied Biosystems 3130. Результаты и обсуждение. Описаны разработка и апробация праймеров к гену msp4Anaplasma marginale для ДНК-диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота методом ПЦР. Чувствительность ПЦР с использованием этих праймеров позволяет выявить 100 и больше копий гена. Проведенные испытания свидетельствуют о 100%-ной повторяемости и воспроизводимости данного метода

Down-Regulated NOD2 by Immunosuppressants in Peripheral Blood Cells in Patients with SLE Reduces the Muramyl Dipeptide-Induced IL-10 Production

Pattern recognition receptors (PRRs) such as Toll-like receptors are aberrantly expressed of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in systemic lupus erythematosus (SLE) patients, for playing immunopathological roles. basal productions of cytokines (IL-6, IL-8 and IL-10) were significantly increased in immunosuppressant naïve patients and patients with active disease despite immunosuppressants compared with HCs. Upon MDP stimulaiton, relative induction (%) of cytokines (IL-1β) from PBMC was significantly increased in immunosuppressant naïve patients with inactive disease, and patients with active disease despite immunosuppressant treatment compared with HCs. Immunosuppressant usage was associated with a decreased basal production and MDP induced relative induction (%) of IL-10 in patients with inactive disease compared with immunosuppressant naïve patients and HCs.Bacterial exposure may increase the NOD2 expression in monocytes in immunosuppressant naïve SLE patients which can subsequently lead to aberrant activation of PBMCs to produce proinflammatory cytokines, implicating the innate immune response for extracellular pathogens in the immunopathological mechanisms in SLE. Immunosuppressant therapy may downregulate NOD2 expression in CD8+ T lymphocytes, monocytes, and DCs in SLE patients which subsequently IL-10 reduction, contributing towards the regulation of immunopathological mechanisms of SLE, at the expense of increasing risk of bacterial infection

Актуальні питання застосування елімінаційних заходів у дітей грудного і раннього віку з харчовою алергією

Objective - to explore the effectiveness of elimination arrangements and the use of milk formulas on the basis of extensive hydrolysis of cow's milk protein and amino acid formulas in infants with allergies to cow's milk proteins. Patients and methods. The study involved 18 children (12 boys and 6 girls) in the age from 1 month to 1 year with severe atopic dermatitis (index EASI>18 points), who were under artificial feeding. All children received therapeutic formulas which contain a significant (extensive) hydrolysis of the whey protein. To the diet of each child gradually was administered the formulas up to the 100% daily volume for 3–4 days. Then therapeutic formula was administered for 4 weeks in an amount which meets the needs of the child's age-old. Evaluation of the clinical efficacy of therapeutic formula was carried out on 7, 14 and 28th day after the full amount of power according to predefined criteria for assessing by 10-point scale (0 — no effect; 10 — an excellent effect) 1 time per week. Results. After applying of therapeutic formula with partial and deep hydrolysis of proteins the SCORAD and EASI indices of most children were significantly decreased. Due to the inefficiency of therapeutic measures in 4 patients with severe manifestations of malabsorption syndrome and the absence of positive dynamics of cutaneous manifestations was used amino acid formula. An amino acid mixture of 100% consisted of free amino acids and represented as a product of dry noodles and intended for the full nutritional care of children from birth. At the end of the study, in all children was noted positive dynamics of weight and body length, the EASI index dynamics (average severity), rated according to the SCORAD scale (estimate of prevalence and intensity eruptions, subjective symptoms by 10-point scale) with the calculation of SCORAD index. Conclusions. It is found that the use of formulas on the base of extensive hydrolysis of cow's milk protein and amino acid formulas in children with food allergy to cow's milk protein allergy and polyvalent allergy is highly effective and safe for treatment. Key words: children, food allergies, treatment, diet therapy.Цель — исследовать эффективность элиминационных мероприятий и применения смесей на основе экстенсивного гидролиза белков коровьего молока и аминокислотных смесей у детей раннего возраста с аллергией на белки коровьего молока. Пациенты и методы. В исследовании приняли участие 18 детей (12 мальчиков и 6 девочек) в возрасте от 1 месяца до 1 года с тяжелым атопическим дерматитом (индекс EASI>18 баллов), которые находились на искусственном вскармливании. Все дети получали лечебные смеси, которые содержат значительный (экстенсивный) гидролиз сывороточного белка. В пищевой рацион каждого ребенка смесь вводили постепенно, достигая 100-процентного суточного объема в течение 3–4 дней. После этого лечебную смесь назначали на 4 недели в количестве, которое отвечало вековым потребностям ребенка. Оценку клинической эффективности лечебной смеси осуществляли на 7, 14 и 28-е сутки после достижения полного объема питания согласно предварительно определенным оценивающим критериям по 10-балльной шкале (0 — отсутствие эффекта; 10 — отличный эффект) 1 раз в неделю. Результаты. После применения лечебной смеси с частичным и глубоким гидролизом белков достоверно снизились индексы EASI и SCORAD у большинства детей. В связи с неэффективностью лечебных мероприятий у 4 пациентов с выраженными проявлениями синдрома мальабсорбции и отсутствием позитивной динамики кожных проявлений, применялась аминокислотная смесь, которая состоит на 100% из свободных аминокислот и является сухим продуктом быстрого приготовления и предназначена для полноценного лечебного питания детей с рождения. На момент окончания исследования у всех детей отмечалась позитивная динамика массы и длины тела, динамика индексов EASI (средний показатель тяжести), оцененный по шкале SCORAD (оценка распространенности и интенсивности высыпки, субъективных признаков по 10-балльной шкале) с расчетом индекса SCORAD. Выводы. Применение смесей на основе экстенсивного гидролиза белков коровьего молока и аминокислотных смесей у детей с пищевой аллергией на белки коровьего молока и поливалентной аллергией является высокоэффективным мероприятием и безопасным лечением. Ключевые слова: дети, пищевая аллергия, лечение, диетотерапия.Мета — дослідити ефективність елімінаційних заходів і застосування сумішей на основі екстенсивного гідролізу білків коров'ячого молока та амінокислотних сумішей у дітей раннього віку з алергією до білка коров'ячого молока. Пацієнти та методи. У дослідженні взяли участь 18 дітей (12 хлопчиків і 6 дівчаток) віком від 1 місяця до 1 року з тяжким атопічним дерматитом (індекс EASI>18 балів), які знаходились на штучному вигодовуванні. Усі діти отримували лікувальні суміші, що містять значний (екстенсивний) гідроліз сироваткового білка. До харчового раціону кожної дитини суміш вводили поступово, досягаючи 100-відсоткового добового об'єму протягом 3–4 днів. Після цього лікувальну суміш призначали на 4 тижні в кількості, що відповідала віковим потребам дитини. Оцінку клінічної ефективності лікувальною сумішшю здійснювали на 7, 14 і 28-ту добу після досягнення повного об'єму харчування згідно з попередньо визначеними оцінювальними критеріями за 10-бальною шкалою (0 — відсутність ефекту; 10 — відмінний ефект) 1 раз на тиждень. Результати. Після застосування лікувальної суміші з частковим і глибоким гідролізом білків достовірно знизилися індекси EASI і SCORAD у більшості дітей. У зв'язку з неефективністю лікувальних заходів у 4 пацієнтів із вираженими проявами синдрому мальабсорбції і відсутністю позитивної динаміки шкірних проявів, застосовувалася амінокислотна суміш, що складається на 100% із вільних амінокислот і є сухим продуктом швидкого приготування та призначена для повноцінного лікувального харчування дітей від народження. На момент закінчення дослідження у всіх дітей відзначалась позитивна динаміка маси і довжини тіла, динаміка індексів EASI (середній показник тяжкості), оцінений за шкалою SCORAD (оцінка поширеності та інтенсивності висипання, суб'єктивних ознак за 10-бальною шкалою) з розрахунком індексу SCORAD. Висновки. Застосування сумішей на основі екстенсивного гідролізу білків коров'ячого молока та амінокислотних сумішей у дітей з харчовою алергією до білка коров'ячого молока і полівалентною алергією є високоефективним заходом і безпечним лікуванням. Ключові слова: діти, харчова алергія, лікування, дієтотерапія