Structure-Function Relationships of the Mycobacterium tuberculosis Transcription Factor WhiB1

Background Members of the WhiB-like (Wbl) protein family possess iron-sulfur clusters and are implicated in the regulation of developmental processes in Actinomycetes. Mycobacterium tuberculosis possesses seven Wbl proteins. The [4Fe-4S] cluster of M. tuberculosis WhiB1 is relatively insensitive to O2 but very sensitive to nitric oxide (NO). Nitric oxide nitrosylates the WhiB1 iron-sulfur cluster and promotes DNA-binding; the apo-forms of WhiB1 also bind DNA. However, the molecular requirements for iron-sulfur cluster acquisition and for DNA-binding by WhiB1 are poorly characterized. Methods and Findings WhiB1 variants were created by site-directed mutagenesis and the abilities of the corresponding proteins to acquire an iron-sulfur cluster and/or bind to whiB1 promoter DNA were assessed. All four Cys residues (Cys9, 37, 40, and 46) in the N-terminal region of WhiB1 were required for incorporation of a [4Fe-4S] cluster, whereas a possible alternative cluster ligand Asp13 (by analogy with M. smegmatis WhiB2) was not. The C-terminal region of WhiB1 is predicted to house the DNA-binding domain of the protein consisting of a predicted β-turn (58GVWGG62) followed by two amino acid motifs (72KRRN75 and 78TKAR81) that are conserved in WhiB1 proteins. Gly residues (Gly58, 61 and 62) in the β-turn and positively-charged residues (Lys72, Arg73, Arg74, Lys79 and Arg81) in the downstream conserved regions were required for binding of WhiB1 DNA. Conclusions Site-directed mutagenesis of M. tuberculosis whiB1 and characterization of the corresponding proteins has been used to explore structure-function relationships of the NO-responsive transcription factor WhiB1. This showed that all four conserved Cys residues in the N-terminal region are required for incorporation of iron-sulfur clusters but not for DNA-binding. Analysis of variants with amino acid substitutions in the C-terminal region revealed the crucial roles played by a predicted β-turn and two conserved positively-charged motifs in facilitating DNA-binding, but not iron-sulfur cluster acquisition, by WhiB1

Producción de forraje de alfalfa con aplicación de fósforo superficial y profunda

El fósforo (P) disponible en los suelos del sudeste bonaerense suele restringir el crecimiento de alfalfa (Medicago sativa L.), y la profundidad de incorporación del fertilizante podría afectar la recuperación del P por el cultivo. Se evaluó durante dos años el efecto de la aplicación superficial (PS) y la aplicación profunda (PP) de P sobre la producción de materia seca (MS) y la acumulación del P aplicado en una pastura de alfalfa. Se estableció un experimento con tres niveles de P (0, 50 y 100 kg P ha-1). Los tratamientos recibieron (como superfosfato triple) 25 kg P ha-1 en la línea de siembra y el resto de las dosis (25 o 75 kg P ha-1) incorporadas con disco superficialmente previo a la siembra (para PS) o con un aplicador a 30 cm de profundidad y 35 cm entre líneas (para PP). Se determinó la producción de MS, la extracción de P por el cultivo, la recuperación aparente del P aplicado y, para los tratamientos de fertilización superficial, el contenido de P extractable (P Bray y Kurtz I). La aplicación de P incrementó la producción de forraje y los tratamientos con PS presentaron mayor producción de MS que los de PP, con valores máximos en el segundo año de evaluación (15.965 y 12.418 kg MS ha-1 para PS100 y PP100, respectivamente y un promedio de 10.153 kg MS ha-1 para los testigos). Aunque la concentración de P en planta fue superior con PS, no fue significativamente diferente de PP. La acumulación de P en el forraje se incrementó por la fertilización, para el segundo año el valor mínimo fue 16 kg P ha-1 (sin P aplicado) y los máximos fueron de 39 y 25,5 kg P ha-1 con PS100 y PP100, respectivamente. Por lo tanto, la recuperación aparente del P aplicado fue mayor para PS con respecto a PP