Transmisión congénita de la enfermedad de Chagas en el Paraguay

Las estrategias actuales recomendadas para el diagnostico de la infección congénita chagásica requieren del diagnóstico serológico convencional en mujeres embarazadas para detectar su infección y la confirmación parasitológica en recién nacidos infectados verticalmente. La detección de parásitos en sangre no resulta un método fácil de aplicar a gran escala y a nivel de salud pública por lo que se recomienda finalmente la serología convencional, es decir la detección de IgG anti-T. cruzi en infantes mayores a 8 meses de edad. Teniendo en cuenta estas recomendaciones nuestro grupo ha diseñado  estrategias operativas en áreas rurales endémicas que permiten la rápida detección y tratamiento de infantes infectados congénitamente. Demostramos que la descentralización de los estudios serológicos de los grandes Hospitales Regionales ayuda a la rápida identificaciónde las mujeres infectadas, como también el registro de su estado de infección en las fichas familiares, prenatal y pediátrica. Los resultados de más de 15 años de estudio de nuestro grupo, indican que a pesar de la alta sensibilidad de la técnica reacción en cadena de la polimerasa (PCR), resulta muy complejo su empleo con fines de diagnóstico a nivelrural y en gran escala, siendo muy útil para evaluar el tratamiento realizado en los niños infectados. La serología convencional permite la detección inequívoca de anticuerpos del tipo IgG en infantes infectados congénitamente después de los 8 meses de edad (tiempo máximo observado para el clearence de anticuerpos maternos). Sin embargo esta estrategia hace que el tiempo requerido en el seguimiento para descartar transmisión congénita disminuya la adherencia durante el periodo de seguimiento con una importante pérdida de niños que no son traídos al control. La detección de casos de transmisión congénita aumenta notablemente cuando se utiliza una combinación de las técnicas serológicas convencionales y un ELISA que hemos diseñado con el antígeno recombinante de fase aguda, “shed acute phase antigen” (SAPA) que permite la detección inequívoca de infantes infectados congénitamente a los 3 meses de edad

Identificación molecular de linajes y sub-linajes de Trypanosoma cruzi en niños infectados congénitamente provenientes de áreas endémicas del Paraguay

La tripanosomiasis americana es una infección causada por un protozoario flagelar Trypanosoma cruzi que está diseminado por todo el continente Americano. T. cruzi es una especie heterogénea que comprende varias sub-poblaciones que circulan en hospederos vertebrados domésticos y salvajes, e invertebrados. Esta diversidad genética ha sido detectada con técnicas moleculares demostrándose que circulan clones mayoritarios en varios hospederos y en diferentes áreas geográficas de América Latina. Aislados de T. cruzi han sido divididos en dos grupos genéticos nombrados por consenso internacional T. cruzi I (linaje 2-asociado al ciclo enzoótico) y T. cruzi II (linaje 1-asociado al ciclo doméstico). La interacción de los clones infectivos de T. cruzi y el hospedero humano podrían determinar la morbilidad de la enfermedad. En este trabajo se empleó la técnica PCR para amplificar genes constitutivos de T. cruzi, como el gen 24S Ribosomal y el gen mini exón (ME) y se detectaron linajes de T. cruzi en 112 muestras (83%) de un total de 135 muestras de niños infectados provenientes de dos departamentos endémicos para la enfermedad de Chagas en Paraguay (Cordillera y Paraguarí). En cuanto a la procedencia de las mismas, 53 muestras eran de Paraguarí y 59 muestras de Cordillera. Los sub-linajes encontrados fueron: Paraguarí: 34TcIIc, 17 TcIId, 1 muestra TcIIb-IIe y 1 muestra ND (no determinada), En Cordillera: 37 TcIIc, 19 TcIId, 1 muestra TcIIb-IIe y 2 muestras no determinadas. No se encontró linaje I, selvático en ninguna de las 2 áreas estudiadas

ＰＣＲ診断法を用いた先天性シャーガス病患者の治療予後判定

長崎大学学位論文 [学位記番号]博（医歯薬）乙第22号[学位授与年月日]平成24年2月1

Análisis filogenético y de presión evolutiva de secuencias nucleotídicas del gen VP4 de especies de enterovirus humanos

El género Enterovirus es un grupo viral que afecta a un amplio rango de hospederos, entre ellos los humanos (especies A, B, C, y D), causan enfermedades respiratorias, gastrointestinales, neurológicas, y otras, y son altamente contagiosos. Los síntomas pueden ser leves o graves. El objetivo del trabajo fue analizar la variación nucleotídica, filogenética y de presión evolutiva de secuencias nucleotídicas del gen VP4 de las cuatro especies que afectan a los humanos. Se emplearon 92 secuencias nucleotídicas disponibles en la base de datos GenBank; éstas se editaron con el software BioEdit y se alinearon con Clustal W; las relaciones filogenéticas se determinaron con MEGA6, y las presiones evolutivas con los algoritmos SNAP y SLAC. Se encontró que la identidad nucleotídica mínima intra-especie fue de 43,2% (especie B) a 72,6% (especie D). Los genotipos más variables por especie fueron EV-71 (A), Echovirus 2 (B), EV-118 (C), y EV-94 (D). El análisis de presión evolutiva mostró que el gen VP4 en las cuatro especies evoluciona bajo presión selectiva negativa. Esto indicaría que la alta tasa mutacional y eventos de recombinación no tienen un rol significativo en la evolución de este gen, debido probablemente a la localización interna de la proteína VP4

Electroferotipos cortos de rotavirus detectados en adultos con diarrea en Paraguay

La presencia de rotavirus en adultos ha sido subestimada por mucho tiempo debido a que la mayor incidencia y patogenicidad se observa en niños menores de 5 años. Con el fin de determinar los electroferotipos circulantes en adultos, se empleó la técnica de PAGE para analizar23 aislados de rotavirus de individuos adultos (promedio de edad: 42,5 años; rango: 24 a 67 años), recolectados entre Septiembre de 2003 a Febrero de 2005 del Laboratorio del Hospital San Roque, Asunción. En las 23 muestras se detectaron 5 electroferotipos diferentes, 19 presentaron alguno de los 3 patrones largos detectados (denominados LA, LB y LC) y 4 presentaron algún patrón corto (SA y SB). Desde 1998 hasta la fecha, nuestro grupo de trabajo detectó un solo caso de rotavirus con patrón corto (aislado en septiembre de 1999) luego de analizar más de 1500 heces de niños con diarrea aguda. Estudios previos en población infantil, han reportado que se necesitan varios años de estudio para identificar rotavirus con patrones cortos en una comunidad, sin embargonuestros resultados sugieren que además es importante ampliar las variables demográficas de la población de estudio para encontrar más variantes de rotavirus, como en este caso es la aparición de patrones cortos en adultos sin que estos se presenten en niños

Técnicas moleculares integradas a la vigilancia entomológica de vectores de la enfermedad de Chagas: Estudio del vector secundario Triatoma sordida en la Región Oriental del Paraguay

Las técnicas moleculares para la detección de infección natural y fuente de alimentación en vectores secundarios de la enfermedad de Chagas cuando son aplicadas a ejemplares capturados en áreas endémicas, históricamente ocupadas por Triatoma infestans, proporcionan a las investigaciones epidemiológicas respuestas más exactas con relación a la transmisibilidad de la enfermedad. El presente estudio tiene como objetivo emplear biomarcadores moleculares para evaluar el impacto de la infestación intra y peridomicilar de Triatoma sordida en viviendas bajo vigilancia entomológica de departamentos de la Región Oriental del Paraguay en el período 2007 al 2015. Un total de 559 ejemplares de T. sordida capturados en 253, 91 y 52 viviendas de los departamentos Paraguarí, San Pedro y Cordillera, respectivamente fueron analizados. La infestación detectada fue del 24% al 48% así como una elevada colonización intradomiciliar del 5% al 36% en los tres departamentos. La detección molecular de infección natural osciló entre el 14% y 44%; y en 111 ejemplares se determinó la fuente de alimentación. El marcador molecular citocromo b permitió demostrar por vez primera un elevado porcentaje de triatominos con sangre humana como fuente de alimentación, principalmente en Cordillera con un 82% (28/34 T. sordida capturados). Estos hallazgos dejan en evidencia el avance del T. sordida en la ocupación del nicho ecológico de T. cruzi y la capacidad de esta especie secundaria como vector en la transmisión de T. cruzi en comunidades de la Región Oriental

Estandarización de la técnica PCR-RFLP del gen mitocondrial cyt b como herramienta para la identificación de fuentes de alimentación de insectos hematófagos

La identificación de la fuente de alimentación de insectos hematófagos puede proporcionar información sobre la capacidad vectorial, patrones de alimentación en condiciones naturales y proveer indirectamente datos sobre probables reservorios de enfermedades. Varias técnicas de identificación son empleadas, entre ellas las más utilizadas son las basadas en reacciones antígeno-anticuerpo. Actualmente, se han desarrollado ensayos moleculares, algunos de ellos permiten detectar e identificar solo sangre humana. Otros como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gen mitocondrial citocromo b (cyt b), que ha mostrado alto grado de sensibilidad y especificidad, permite detectar e identificar otras especies de vertebrados. El objetivo del trabajo fue estandarizar la técnica PCR-RFLP del gen mitocondrial citocromo b (cyt b) para determinar la fuente de alimentación sanguínea de insectos. Inicialmente se  realizó un análisis bioinformático para la búsqueda y alineamiento de secuencias del gen cyt b de los potenciales huéspedes, con secuencias que están disponible en el GenBank. Se utilizaron 10 muestras de sangre de potenciales huéspedes vertebrados (humano, perro, gallina y roedor) y para la reacción de PCR se empleó un par de cebadores universales que amplifican una región del gen cyt b, seguido de cortes con dos enzimas de restricción (RFLP) (Hae III y Mwo I), generando patrones de electroforesis específicos para los diferentes vertebrados. Se logró la estandarización de la técnica de PCR del gen cyt b que fue capaz de detectar ADN de al menos 1 μL de sangre observándose el producto de amplificación de 358 pb. El análisis de los patrones de bandas obtenidos con el corte de las enzimas mostró los tamaños de fragmentos esperados para humano, gallina, perro y roedor. Estos resultados muestran la utilidad de la técnica PCR-RFLP del gen cyt b que, con un simple par de cebadores seguido del corte con dos enzimas de restricción, permitió diferenciar las diferentes especies de vertebrados de nuestro interés a través de los patrones obtenidos sin llegar a la secuenciación y también presenta la ventaja de utilizar pequeños volúmenes de sangre

Aplicación de la PCR para la detección de género y complejos de Leishmania en diferentes tipos de muestras biológicas

La leishmaniosis es una enfermedad producida por diferentes especies del protozoario Leishmania agrupados en complejos, es transmitida por flebótomos presentando una variedad de síntomas clínicos. La técnica reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite amplificar regiones blanco específicas del género Leishmania y de los complejos Leishmania donovani y Leishmania braziliensis, directamente en muestras biológicas sin cultivos in vitro previo. En este estudio se realizó una evaluación descriptiva, durante el periodo 2001 a 2006, analizando 169 biopsias (piel y mucosas) y 31 aspirados de médula ósea en pacientes con sospecha clínica de leishmaniosis, además se evaluaron 44 muestras de bazo de caninos. Las muestras procedían de distintas zonas endémicas del país. Se detectó género Leishmania en el 71% de las biopsias (piel y mucosas), en 68% en los aspirados de médula ósea y en 82% de los bazos de caninos. Se identificó el complejo L. braziliensis en los pacientes con leishmaniosis cutánea y mucosa y el complejo L. donovani en pacientes con la forma visceral. Estos resultados han demostrado la utilidad de la técnica de PCR para la detección y caracterización de los parásitos de Leishmania en distintas muestras biológicas

Primer reporte de un caso importado de Malaria por Plasmodium ovale curtisi en Paraguay, confirmado por diagnóstico molecular

En países donde el Plasmodium ovale no es común, los microscopistas tienden a identificarlo de manera errónea como Plasmodium vivax. En este trabajo reportamos la identificación de la especie P. ovale curtisi por el método de PCR múltiple semianidada (SnM-PCR) y la secuenciación de la subunidad pequeña del gen del ARN 18S, en un paciente paraguayo de 44 años de edad que vino en el 2.013 de Guinea Ecuatorial, África Occidental, a quien se le diagnosticó una infección por P. vivax por microscopía convencional. El empleo de métodos moleculares para la identificación de casos importados de infección con especies del género Plasmodium es uno de los objetivos principales en el control y la prevención de la malaria en Paraguay, teniendo en cuenta que el país se encuentra en fase de pre-eliminación de la enfermedad

Genotipificación por MIRU-VNTR de aislados de mycobacterium tuberculosis remitidos al Hospital Km 81 en el año 2008

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecto-contagiosa causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) que aún constituye un problema de salud pública en Paraguay. Este estudio piloto de tipo observacional descriptivo de corte transverso tuvo como objetivo caracterizar aislados de Mtb mediante la técnica molecular "Mycobacterial Interspersed Repetitive Units-Variable Number Tandem Repeats" (MIRU-VNTR). Se han utilizado 19 aislados colectados durante el 2008 en el Hospital Km 81, departamento de Cordillera. Las muestras fueron sometidas a amplificación de 12 loci MIRU-VNTR seguido de electroforesis en gel de poliacrilamida. Los patrones genéticos fueron clasificados haciendo uso de la herramienta bioinformática MIRU-VNTRplus. El Índice de Diversidad de Hunter Gaston (HGDI) determinó que los loci MIRU 10 y MIRU 40 presentaron el mayor poder discriminatorio. Se encontraron 4 cepas en 2 clados con 100% de similitud. Además, se hallaron 12/19 cepas en 4 clados con 80% de similitud. Estudios adicionales son necesarios para determinar asociaciones epidemiológicas. MIRU-VNTR agrupó las cepas estudiadas con miembros de las familias LAM, Haarlem y X con predominio de la familia LAM (79%)Fil: Duarte Fleitas, Mara Melissa. Universidad Nacional de Asunción (Paraguay).Fil: Díaz Acosta, Chyntia Carolina . Universidad Nacional de Asunción (Paraguay).Fil: Russomando Álvarez, Graciela Mabel. Universidad Nacional de Asunción (Paraguay)