Concentraciones bajas de extracto de semilla de uva mantienen la morfología de los osteoblastos, la adhesión celular y la mineralización

El aumento de la esperanza de vida ha provocado una mayor incidencia de la osteoporosis, caracterizada por un desequilibrio en el remodelado óseo. Se utilizan varios fármacos para su tratamiento, pero la mayoría promueven efectos secundarios indeseables. La presente investigación evaluó los efectos de dos concentraciones bajas de extracto de semilla de uva (ESG) rico en proantocianidinas sobre células osteoblásticas MC3T3-E1. Las células se cultivaron en un medio osteogénico y se dividieron en grupos de control (C), 0,1 µg/mL de GSE (GSE0,1) y 1,0 µg/mL de GSE (GSE1,0) para evaluar la morfología, adhesión y proliferación celular, la detección in situ de fosfatasa alcalina (ALP), la mineralización y la inmunolocalización de la osteopontina (OPN). Los datos obtenidos se analizaron mediante pruebas estadísticas para una significación del 5%. La morfología celular se mantuvo con ambas concentraciones de GSE, mientras que la adhesión celular aumentó significativamente a los tres días en todos los grupos. La proliferación celular aumentó significativamente a los siete días de cultivo, seguida de un descenso significativo en todos los periodos experimentales, sin diferencias estadísticas entre ellos. La detección in situ de ALP y mineralización aumentó con el tiempo, pero dentro de cada período no se observaron diferencias estadísticas entre los grupos. La expresión de la osteopontina se distribuyó regularmente con mayor intensidad a las 24 horas en el grupo GSE0.1. A los tres días, la expresión de OPN era más intensa en el grupo de control, seguido de los grupos GSE0.1 y GSE1.0. Los datos obtenidos sugieren que bajas concentraciones de GSE no afectan a la morfología y pueden estimular la actividad funcional de las células osteoblásticas.The increase in life expectancy has led to a higher incidence of osteoporosis, characterized by an imbalance in bone remodeling. Several drugs are used for its treatment, but most promote undesirable side effects. The present investigation evaluated the effects of two low concentrations of grape seed extract (GSE) rich in proanthocyanidins on MC3T3-E1 osteoblastic cells. The cells were cultured in an osteogenic medium and divided into control (C), 0.1 µg/mL GSE (GSE0.1), and 1.0 µg/mL GSE (GSE1.0) groups to evaluate cell morphology, adhesion, and proliferation, in situ alkaline phosphatase (ALP) detection, mineralization and immunolocalization of osteopontin (OPN). The data obtained were analyzed by statistical tests for a significance of 5%. Cell morphology was maintained with both GSE concentrations, whereas cell adhesion significantly increased within three days in all groups. Cell proliferation increased significantly at seven days of culture, followed by a significant decrease in all experimental periods, with no statistical difference among them. In situ detection of ALP and mineralization increased with time, but within each period, no statistical differences among groups were observed. The expression of osteopontin was distributed regularly with more intensity after 24 hours in the GSE0.1 group. After three days, OPN expression was more intense in the control group, followed by GSE0.1 and GSE1.0 groups. Data obtained suggest that low concentrations of GSE do not affect the morphology and may stimulate the functional activity of osteoblastic cell

Avaliação da diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais de ratos tratados cronicamente com bifosfonatos

Apesar dos bifosfonatos (BPs), fármacos antirreabsortivos, atuarem principalmente nos osteoclastos, a ação desses medicamentos em osteoblastos tem sido demonstrada em experimentos in vitro. Porém, na maioria desses experimentos, há exposição das culturas de osteoblastos aos BPs. Na presente investigação, foram avaliados osteoblastos diferenciados a partir de células-tronco mesenquimais (CTMs) de ratos tratados in vivo com alendronato de sódio (ALE: 1mg/ml/kg/semana), ácido zoledrônico (ZOL: 0,3mg/ml/kg/semana) ou solução salina (VEH: 0,009mg/ml/kg/semana) durante 13 semanas. As CTMs da medula óssea dos fêmures direitos dos animais foram cultivadas em meio osteogênico, na densidade de 5.000 células/200μl/poço. Após 21 dias de cultura, osteoblastos foram avaliados quanto à viabilidade celular e à formação de matriz mineralizada. Foram observadas viabilidades celulares semelhantes nos grupos BPs (ALE e ZOL) e superiores ao controle (VEH). Quanto à formação da matriz mineralizada, houve maior mineralização no grupo ZOL em relação ao grupo ALE, sendo ambas inferiores ao observado no grupo VEH. Os resultados obtidos sugerem que a exposição in vivo das CTMs ao ALE e ao ZOL influenciou a atividade dos osteoblastos in vitro. Ambos os medicamentos utilizados são BPs nitrogenados; contudo, na dose empregada, o ALE afetou mais significativamente a formação de matriz mineralizada

Effect of grape seed extract rich in proanticianindins in the bone tissue of ovariectomized rats

A osteoporose é uma patologia óssea altamente prevalente, caracterizada pela alteração na microarquitetura e densidade do tecido ósseo, tornando-o frágil e suscetível a fraturas. Para o tratamento desta patologia são prescritos antirreabsortivos que reduzem a reabsorção óssea, porém, estes fármacos são comumente associados a efeitos adversos. Uma terapia alternativa seria o uso de substâncias naturais, como o extrato de semente de uva (GSE) rico em proantocianidinas (PACs), que apresenta propriedades antioxidantes, com potencial de favorecer o metabolismo dos tecidos cartilaginoso e ósseo. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do GSE rico em PACs no metabolismo do tecido ósseo de ratas ovariectomizadas e seu efeito em cultura de células osteoblásticas. Os experimentos in vivo foram realizados com ratas Wistar Hannover divididas em 3 grupos: SHAM, ovariectomizado (OVX) e ovariectomizado + GSE (OVX+GSE). imediatamente após a ovariectomia os animais do grupo OVX+GSE receberam 250 mg/Kg de peso corporal do GSE por meio de sonda gástrica, enquanto que os grupos SHAM e OVX receberam água. Noventa dias após a ovariectomia, as ratas foram submetidas à eutanásia e o sangue foi coletado para a análise de cálcio, fósforo e fosfatase alcalina. Os fêmures foram coletados para análise histológica qualitativa e quantitativa, histoquímica do TRAP (Fosfatase Ácida Resistente ao Tartarato) e análise da birrefringência de colágeno por coloração com Picro-Sirius. Os experimentos in vitro foram realizados com as células pré-osteoblasticas MCPC-23, cultivadas em meio osteogênico e divididas em grupos controle (C), 0.1 &micro;g/mL GSE (GSE0.1), e 1.0 &micro;g/mL GSE (GSE1.0) para avaliar a adesão celular, proliferação e mineralização. Os dados obtidos foram analisados por teste estatístico para p<0.05. Os resultados in vivo mostraram que o grupo OVX apresentou redução significativa da quantidade de matriz extracelular e da área de osso e aumento na quantidade de tecido conjuntivo em comparação aos grupos SHAM e OVX+GSE. Porém, não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos para o número de osteócitos. Também não foram observadas diferenças significativas para os marcadores séricos. Embora a análise qualitativa ordinal da distribuição e arranjo do colágeno não tenha mostrada diferenças estatisticamente significativas entre os grupos SHAM, OVX e OVX+GSE, no grupo OVX+GSE observou-se proporção semelhante das birrefringências verde e vermelho, com discreta predominância da birrefringência verde, sugerindo possíveis efeitos do extrato na remodelação da matriz óssea. Os experimentos in vitro mostraram que a adesão celular aumentou significativamente em todos os grupos. A proliferação celular aumentou significativamente aos 7 dias de cultura, sem diferença entre os grupos. A mineralização aumentou significativamente ao longo da cultura, sem diferença entre os grupos. Deste modo, os resultados obtidos sugerem que o GSE rico em PACs não afeta a atividade funcional de células osteoblásticas assim como pode impedir a perda de matriz óssea, sendo uma substância com potencial para ser utilizada em casos de osteoporose.Osteoporosis is a highly prevalent, asymptomatic bone pathology characterized by changes in the microarchitecture and density of bone tissue, making it fragile and susceptible to fractures. For the treatment of this pathology, antiresorptive drugs that reduce bone resorption are prescribed, however, these drugs are commonly associated adverse effects. An alternative therapy would be the use of natural substances, such as grape seed extract (GSE) rich in proanthocyanidins (PACs), which has antioxidant properties, favoring the metabolism of cartilage and bone tissue. Therefore, this study aimed to evaluate the effect of GSE rich in PACs on the bone tissue of ovariectomized rats and its effects on osteoblastic cell culture. Wistar Hannover rats were divided into 3 groups: SHAM, ovariectomized (OVX) and ovariectomized + GSE (OVX+GSE). The animals in the OVX+GSE group immediately received 250 mg/kg of body weight of the GSE by means of a gastric tube, three times a week, whereas the SHAM and OVX groups received water. Ninety days after ovariectomy, the rats were euthanized and blood was collected for analysis of calcium, phosphorus and alkaline phosphatase. Femurs were collected for qualitative and quantitative histological analysis, TRAP histochemistry (Tartrate-Resistant Acid Phosphatase) and collagen birefringence analysis using Picro-Sirius. In vitro experiments were also performed to evaluate the effects of two low concentrations of grape seed extract (GSE) rich in proanthocyanidins on MC3T3-E1osteoblastic cells. The cells were cultured in osteogenic medium and divided into control (C), 0.1 &micro;g/mL GSE (GSE0.1), and 1.0 &micro;g/mL GSE (GSE1.0) groups to evaluate cell adhesion and proliferation, as well as mineralization. The data obtained were analyzed by statistical tests for significance of 5%. The OVX group showed a significant reduction in the amount of extracellular matrix and bone area and an increase in the amount of connective tissue compared to the SHAM and OVX+GSE groups. However, no significant differences were found between the groups for the number of osteocytes. No significant differences were observed for serum markers either. Although the qualitative ordinal analysis of collagen distribution and arrangement did not show statistically significant differences between the SHAM, OVX and OVX+GSE groups, the OVX+GSE group observed a similar proportion of green and red birefringence, with a slight predominance of green birefringence, suggesting possible effects of the extract on bone matrix remodeling. In vitro experiments showed that cell adhesion significantly increased within three days in all groups. Cell proliferation increased significantly at seven days of culture, followed by a significant decrease in all experimental periods, with no statistical difference among them. Mineralization increased with time, but within each period, no statistical differences among groups were observed. Thus, the results obtained suggest that GSE rich in PACs do not affect osteoblast cell functional activity as well as avoid the loss of bone extracellular matrix and the bone area, being a substance with potential to be used in a situation of osteoporosis