Evaluación del rol funcional del gen VviPSZ3 en el desarrollo reproductivo de Vitis vinífera L. cv. Carménère. Análisis mediante complementación del mutante zat4 de Arabidopsis thaliana

136 p.Vitis vinifera L. es un importante cultivo frutal a nivel mundial. Por esta razón, es esencial comprender el desarrollo reproductivo de esta especie. Sin embargo, en la actualidad se tiene escaso conocimiento sobre su control genético. Algunos cultivares de vides, como Carménère, presentan alta incidencia en el desarrollo de frutos partenocárpicos, los cuales se forman sin el proceso de doble fecundación, por consiguiente, no presentan semillas, permaneciendo pequeños y verdes hasta la maduración. El polen desempeña un papel fundamental en la fertilidad de la planta, a través de la entrega de los gametos masculinos al saco embrionario, para que ocurra la doble fecundación. En especies modelos, se han descrito factores de transcripción del tipo C2H2 zinc-finger (C2H2-ZF) involucrados en diferentes estadios del desarrollo y maduración del polen. En la vid, VviPSZ3 es un C2H2-ZF que estaría involucrado en el desarrollo del polen y semillas. En este trabajo, se posicionó a VviPSZ3 en la red regulatoria del desarrollo de polen y semillas. Primero, se determinó el patrón temporal del desarrollo floral y del polen en la vid, posicionando el desarrollo del polen entre los estadios 13 y 15 del sistema E-L. Con estos antecedentes, se determinó que VviPSZ3 se expresa tardíamente en el desarrollo de anteras y polen. Luego, se expresó VviPSZ3 en el genotipo mutante de Atzat4, un putativo ortólogo en Arabidopsis thaliana. Se caracterizó fenotípicamente el mutante Atzat4 (+/-), como putativo ortólogo de VviPSZ3, observándose defectos en la línea germinal masculina, mostrando defectos en la germinación y elongación del tubo polínico. Además, Atzat4 (+/-) presentó una reducida fertilidad, con un menor número de semillas por silicua, las cuales, además, mostraron una reducida viabilidad y germinación; de igual manera mostró un tamaño de silicua menor al compararse con el WT. La expresión de VviPSZ3 en Atzat4 restableció el fenotipo silvestre, mostrando corrección de los defectos en el desarrollo del polen y semillas, previamente caracterizados en el mutante, sugiriendo que ambos factores de transcripción son ortólogos. Finalmente, se identificaron putativos genes blanco de VviPSZ3, en plantas transgénicas de A. thaliana, los cuales estarían involucrados en procesos del desarrollo y maduración del grano de polen, fundamentalmente, durante la formación de la pared y la cubierta del polen; además, durante el proceso de polinización y doble fecundación. Asimismo, se identificaron genes blancos de VviPSZ3, que participan en el desarrollo del embrión y las semillas. Con estos resultados, se puede concluir que VviPSZ3 estaría involucrado en procesos reproductivos de V. vinifera cv. Carménère, asociado al desarrollo del polen y semillas. // ABSTRACT: Vitis vinifera L. is an important fruit crop worldwide. For this reason, it is essential to understand its reproductive development. However, currently there is little knowledge about its genetic control. Some grapevine cultivars, such as cv. Carménère, have a high incidence in the development of parthenocarpic fruits, which forms without the double fertilization process, and consequently, do not present seeds, remaining small and green until maturation. Pollen plays a fundamental role in plant fertility, through the delivery of male gametes to the embryo sac, to double fertilization occurs. In model species, C2H2-type zinc-finger transcription factors (C2H2-ZF) have been involved in different pollen development and maturation stages. In grapevine, VviPSZ3 is a C2H2-ZF that would be involved in pollen and seeds development. In this work, VviPSZ3 was positioned in the pollen and seed development regulatory network. First, the flower and pollen development timing on the grapevine, was determined, positioning pollen development between stages 13 and 15, in the E-L system. With this background, it was determined that VviPSZ3 was expressed late in the anther and pollen development. Then, VviPSZ3 was introduced in the mutant genotype of Atzat4, a putative ortholog in Arabidopsis thaliana. The mutant Atzat4 (+/-) was characterized phenotypically, as a putative orthologue of VviPSZ3, observing defects in the male germline, and showing defects in the pollen tube germination and elongation. Furthermore, Atzat4 (+/-) presented reduced fertility, with a lower number of seeds per silique, which also, showed reduced viability and germination. It also exhibited a smaller silique size than the WT. The expression of VviPSZ3 in Atzat4 restored the wild phenotype corrected the defects in pollen and seeds development, previously characterized in the mutant, suggesting that both transcription factors are orthologous. Finally, VviPSZ3 target genes were identified in A. thaliana transgenic plants, which would be involved in processes of pollen grain development and maturation, fundamentally, during the pollen wall and coat formation; moreover, during pollination and double fertilization process. Besides VviPSZ3 target genes were identified, involved in the embryo and seeds development. With these results, it is concluded that VviPSZ3 would be involved in V. vinifera cv. Carménère reproductive processes, related to pollen and seed development

Identificación y caracterización de factores de transcripción del tipo C2H2-ZFP involucrados en el desarrollo del polen de Vitis vinifera

142 p.En la vid (Vitis vinifera L.) se ha sugerido que malformaciones generadas en el desarrollo del polen, reduce el potencial de germinación y la entrega de células espermáticas a los óvulos, aumentando la incidencia del desarrollo de frutos partenocárpicos (DFP), con un impacto negativo en la calidad del vino. Los mecanismos reguladores que controlan la formación de polen siguen siendo desconocidos en la vid. Sin embargo, en otras plantas se ha revelado una red que involucra varios tipos de factores de transcripción través del modelo (A)B(C) del desarrollo floral y se han asignado roles clave a los miembros de la familia de proteínas con dedos de zinc del tipo C2H2 (ZFP). Factores de este tipo han sido asociados a la regulación del desarrollo del polen en petunia, arabidopsis, y otras especies. El silenciamiento de algunos de estos genes provoca alteraciones morfológicas y funcionales en los granos de polen, en las diferentes etapas del desarrollo de estos. La identificación en el genoma de la vid tanto de genes homólogos a aquellos que regulan el desarrollo de anteras y polen en Arabidopsis thaliana, así como genes homólogos a la familia EPF de petunia, permite sugerir que los mecanismos moleculares similares a los descritos en estas especies modelo, regulan el desarrollo del polen en la vid. Basado en ello se planteó como hipótesis de trabajo: “La regulación del desarrollo del polen involucra la participación de proteínas factores de transcripción del tipo C2H2-ZFP en Vitis vinifera L.” Para comprender mejor el papel de las ZFP en el desarrollo del polen se realizó una búsqueda de genoma amplio identificando un grupo de 98 genes que codifican para ZFP (familia VviZFP), ampliamente distribuidos en el genoma de la vid. Luego de una caracterización general, se seleccionó un grupo de genes VviZFPs presumiblemente implicados en el desarrollo del polen, de acuerdo con su perfil de expresión in silico y homología con ZFP que regulan el desarrollo del polen, informado en otras plantas modelo. Posteriormente, se posicionaron eventos del desarrollo del polen dentro de la escala del desarrollo floral/frutal en vid (Sistema E-L), con análisis de microscopía y de expresión relativa de genes relacionados en el cultivar ‘Carmenere’. En este cultivar, la especificación de células madre del polen es visible a partir del estadio E-L13 y el desarrollo del polen ocurre entre el estadio E-L13 y E-L16. Luego, se determinó la expresión temporal de un set de genes VviZFP candidatos durante un periodo de la segunda temporada del desarrollo floral de la vid, se identificaron elementos de respuesta en las regiones promotoras de estos genes (2000 pb desde el codón de inicio de la transcripción) y finalmente se determinó la actividad órgano específica de la región promotora de VviZFP11 y VviZFP67. Todos los genes VviZFP seleccionados mostraron dinámicas de expresión a lo largo del desarrollo floral, lo que sugiere una posible participación de estos en el desarrollo de la vid. Las regiones promotoras presentaron diferentes niveles de enriquecimiento con elementos reguladores cis de respuesta a factores de transcripción, de señalización hormonal y elementos de expresión específicos del polen. Se observaron diferencias en la actividad espacio/temporal de los promotores entre VviZFP68 y el ortólogo propuesto PhMEZ1, sugiriendo roles diferentes para ambos genes. Por otro lado, el promotor del gen VviZFP13 presenta actividad similar a lo observado en AtDAZ1/2, además de actividad específica en tejido estigmático, haciéndolo interesante para estudios posteriores. Sin embargo, los perfiles de expresión indican que estos genes están siendo transcritos durante el momento del desarrollo del polen en vid. Finalmente, los resultados generados en esta tesis permiten generar una fuente de información importante que será útil a la hora de desarrollar trabajos posteriores que persigan comprender la participación de un grupo reducido de VviZFPs en eventos del desarrollo del polen en la vid. // ABSTRACT: In grapevine (Vitis vinifera L.) it has been suggested that malformations generated in the development of pollen, reduces the potential for germination and the delivery of sperm cells to the ovules, increasing the incidence of parthenocarpic fruit development (DFP), with an impact negative on the wine quality. The regulatory mechanisms that control pollen formation remains unknown in grapevine. However, in other plants a network involving various types of transcription factors has been revealed through the (A)B(C) model of flower development and key roles have been assigned to members of the C2H2 type zinc finger protein family (ZFP). Factors of this type have been associated with the regulation of pollen development in petunia, arabidopsis, and other species. The silencing of some of these genes causes morphological and functional alterations in pollen grains, at different stages of their development. The identification in the grapevine genome of genes homologous to those that regulate the development of anthers and pollen in Arabidopsis thaliana as well as genes homologous to the EPF family of petunia, allows us to suggest, that molecular mechanisms similar to those described in these model species regulate the pollen development in grapevine. Based on this, it is proposed as a working hypothesis: "The regulation of pollen development involves the participation of C2H2-ZFP-type transcription factor proteins in Vitis vinifera L." To better understand the role of ZFPs in pollen development, a genome-wide search was carried out identifying a group of 98 genes that code for ZFP (VviZFP family), widely distributed in the grapevine genome. After a general characterization, a group of VviZFPs genes presumably involved in pollen development was selected according to their in silico expression profile and homology with ZFP that regulate pollen development reported in other model plants. Subsequently, pollen development events were positioned within the scale of floral/fruit development in grapevine (E-L System), with microscopy analysis and relative expression of related genes in the ‘Carmenere’ cultivar. In this cultivar, the pollen stem cell specification is visible from stage E-L13 and pollen development occurs between stage E-L13 and E-L16. Then, the temporal expression of a set of candidate VviZFP genes were determined during a period of the second season of floral development in grapevines, response elements were identified in the promoter regions of these genes (2000 bp from the start codon) and finally the specific activity of the promoter region of VviZFP11 and VviZFP67 were determined. All the VviZFP genes showed these expression dynamics throughout flower development, suggesting a possible participation in grapevine development. The promoter regions present different levels of enrichment with cis regulatory elements of response to transcription factors, hormonal signaling, and pollen-specific expression elements. Differences in the spatial/temporal activity of the promoters are observed between VviZFP68 and the proposed PhMEZ1 ortholog, suggesting different roles for both genes. On the other hand, the promoter of the VviZFP13 gene presents activity similar to that observed in AtDAZ1/2, in addition to specific activity in stigmatic tissue, making it interesting for subsequent studies. However, the expression profiles indicate that these genes are being transcribed during the time of pollen development in grapevine. Finally, the results generated in this thesis allow generating an important source of information that will be useful when developing subsequent works that seek to understand the participation of a small group of VviZFPs in grapevine pollen development events