Molekulare Mechanismen im Prozess der Zellreprogrammierung

Die bahnbrechende Entdeckung, dass somatische Zellen einen stabilen pluripotenten Zustand durch die ektopische Expression von spezifischen Transkriptionsfaktoren annehmen können, hat die Möglichkeiten der regenerativen Medizin wesentlich erweitert. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) haben sich zu einem außerordentlich wertvollen Instrument entwickelt, um patientenspezifische Therapien zu ermöglichen. Obwohl große technologische Fortschritte in der Verbesserung der Methodik erzielt wurden, sind die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen im Prozess der Zellreprogrammierung weitgehend unbekannt. Um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, welche die Induktion der Pluripotenz vorantreiben oder verhindern, wurden in dieser Arbeit genomweit Transkriptionsprofile humaner Fibroblasten nach Überexpression der Reprogrammierungsfaktoren, OCT4, SOX2, KLF4 und c-MYC, einzeln und in Kombination untersucht. Die Analyse des Transkriptoms in der frühesten Phase der Reprogrammierung ermöglichte die Identifizierung von Signalwegen, die primär für die Reprogrammierung von somatischen Zellen verantwortlich sind. Diese Signalwege wurden in ein mathematisches Modell integriert, das zur funktionalen Analyse der identifizierten Komponenten und Signalwege genutzt wurde. Dies ermöglichte die Aufstellung von Hypothesen über die der Reprogrammierung zugrundeliegenden molekularen Mechanismen. Die aufgestellten Hypothesen wurden anhand der beiden wichtigsten involvierten Proteine, p53 und TGFβ-Rezeptoren, während des Prozesses der Reprogrammierung überprüft. Dabei wurden p53 genetisch und der TGFβ-Rezeptor pharmakologisch untersucht. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen, dass die beginnende Reprogrammierung somatischer Zellen einen an den embryonalen Zellzyklus angelehnten Mechanismus verfolgt. Der synergistische Effekt der Reprogrammierungsfaktoren reguliert den TGFβ- und den p53-Signalweg und mindert damit die Anti-Wachstums-Reaktionen, die Hürden für die Reprogrammierung wären. Die Unterdrückung dieser Signalwege schaltet die G1-S Phase Kontrollpunkte aus und ermöglicht so einen den embryonalen Stammzellen ähnlichen Zellzyklus. Schnellere G1-S Übergänge reduzieren die Aktivität des Replikations-Reparaturmechanismus und bevorzugen die homologe Rekombination, welche damit zum dominierenden Reparaturmechanismus in der Zelle wird.The landmark discovery that lineage-restricted cells can acquire a stable pluripotent state through the ectopic expression of a specific set of transcription factors has expanded the boundaries of regenerative medicine to a yet indefinite end. Induced pluripotent stem cells (iPS) have emerged as an invaluable tool for generating patient-specific therapies. Even though, many technical advances have been made to improve the methodology less is known about the molecular mechanisms involved in the process of reprogramming. In order to investigate the molecular mechanisms that promote or hinder the induction of pluripotency I have studied the genome-wide transcriptional profile of human fibroblasts after over-expression of the reprogramming transcription factors (OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC) independently and in combination. The analysis of the transcriptome at the early stages of the reprogramming permitted the identification of the foremost pathways involved in the reprogramming of somatic cells. Moreover, these pathways were given functional meaning by assembling a mathematical model that helped to propose hypotheses about the molecular mechanisms driving the reprogramming process. These hypotheses have been validated in loss of function experiments by targeting genetically or pharmacologically the most relevant proteins involved, as p53 and TGFβ receptor, during the reprogramming process. The data presented in this work demonstrate that the reprogramming of somatic cells begins in the pursuit of a rapid, embryonic-like, cell cycle. The synergistic effect of the reprogramming factors regulates the TGFβ and the p53 signalling pathway reducing their related anti-growth responses, barriers to reprogramming. Regulation of these pathways eliminates the G1-S transition checkpoint promoting a cell cycle progression similar to embryonic stem cells. In addition, I probed that this regulation of the cell cycle has down-stream effects on DNA damage responses and apoptosis. Faster G1-S transitions reduced the activity on replication-related repair mechanisms in favour of homologous recombination that became the most prominent repair mechanism in the cells