Elektronen- und Protonentransport der Cytochrom-c-Oxidase aus Paracoccus denitrificans

Obwohl die Kristallstrukturen der Cytochrom­c­Oxidase aus Rinderherz­Mitochondrien und dem Bodenbakterium P. denitrificans bekannt sind und die Funktionsweise des Enzyms mit Hilfe zahlreicher Methoden bereits intensiv untersucht wurde, wird nach wie vor kontrovers diskutiert, an welcher Stelle im katalytischen Zyklus wieviele Protonen aufgenommen bzw. gepumpt werden und über welchen der beiden Protoneneintrittspfade dies geschieht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diesen Fragestellungen mit Hilfe von elektrischen Messungen nachzugehen, um dann ein genaueres Bild von der mechanistischen Funktionsweise des Enzyms zu erhalten. Hierzu wurden Teilschritte des katalytischen Zyklus der Cytochrom­c­Oxidase aus P. denitrificans genauer untersucht. Dies gelang durch Spannungsmessungen an der schwarzen Lipidmembran mit Ru II (2,2'­bipyridyl) 3 Cl 2 (Rubpy) als lichtinduzierbarem Einelektronendonor. Es konnte gezeigt werden, daß ausgehend vom vollständig oxidierten Zustand O nach Lichtanregung ein Elektron von Rubpy auf die Oxidase übertragen und anschließend vom CuA zum Häm a mit einer Zeitkonstanten von » 20 µs transportiert wird. Zeitaufgelöste spektroskopi­ sche Messungen deuten darauf hin, daß das Elektron auf dem Häm a verbleibt. Die Reduktion dieses Kofaktors führt zu einer Protonenaufnahme über den K­Weg mit einer Zeitkonstanten von » 175 µs. Nimmt man an, daß sich Häm a in der Mitte des Dielektrikums befindet (Hinkle und Mitchell, 1970), so deuten die relativen Amplituden der beiden Phasen an, daß etwa 0.8 Protonen aufgenommen werden, in sehr guter Übereinstimmung mit (Capitanio et al., 2000). Aus Mehrfachblitz­Experimenten unter anaeroben Bedingungen, ausgehend vom O­Zustand, konnten erste Erkenntnisse über den E ® R Übergang gewonnen werden, nämlich daß hierbei ein Prozeß mit einer Zeitkonstanten von ca. 1.1 ms auftritt und daß sowohl K­ als auch D­Weg an diesem Teilschritt des katalytischen Zyklus beteiligt sind. Da mit der Mehrfachblitz­Methode aber immer ein Gemisch aus verschiedenen Zuständen entsteht, war es nicht möglich, quantitative Aussagen über die Zahl der transportierten Ladungen zu treffen. Aus diesem Grund wurde eine Möglichkeit gesucht, den E­Zustand in hoher Ausbeute mit ausreichender Stabilität herzustellen, um dann ein Elektron zu übertragen. Dies gelang durch Darstellung des Oxoferryl­Zustandes F mit Hilfe von H 2 O 2 und anschließende Zweielektronenreduktion durch CO. Die Übertragung von einem Elektron auf den so gebildeten E­Zustand lieferte 3 Phasen im Spannungssignal mit Zeitkonstanten von » 25 µs, » 200 µs und » 1.5 ms. Die relativen Amplituden dieser Phasen und die Ergebnisse von K­ und D­Weg­Mutanten legen nahe, daß nach Aufnahme des 2. Elektrons vermutlich ein Proton über den K­Weg aufgenommen und anschließend 1 Proton über den D­Weg gepumpt wird. Es konnte somit zum ersten Mal gezeigt werden, daß bereits während des reduktiven Teils (O ® R) des katalytischen Zyklus ein Proton von der intrazellulären zur extrazellulären Seite transportiert wird und zwar ohne daß unmittelbar vorher die Sauerstoffreduktion stattgefunden haben muß. Erste Experimente zum P ® F Übergang lassen sich so deuten, daß mit Aufnahme des 3. Elektrons ein Proton zum binuklearen Zentrum transportiert und mindestens 1, wenn nicht gar 2 Protonen durch das Enzym gepumpt werden. Hier sind noch weitere Experimente nötig, um die genaue Zahl der transportierten Ladungen und die für die einzelnen Protonenbewegungen verwendeten Protoneneintrittspfade zu bestimmen. Messungen zum F ® O Übergang schließlich zeigten, daß nach dem CuA ® Häm a Elektro­ nentransfer mit einer Zeitkonstanten von ca. 25 µs vermutlich 1 Proton über den D­Weg bis zu den Hämen transportiert (t » 270 µs) und anschließend ein Proton ebenfalls über den D­Weg gepumpt wird (t » 1.5 ms). Aus den gewonnenen Daten wurde ein neuer Mechanismus für die Sauerstoffreduktion in der Paracoccus­COX entwickelt. Dieser beruht auf dem von Mitchell und Rich postulierten Elektroneutralitätsprinzip (Mitchell und Rich, 1994) und ist stark an das von Michel vorgeschlagene Modell (Michel, 1998; Michel, 1999) angelehnt. Zur Klärung der Fragen, ob sich bakterielles und Rinderz­Enzym eventuell in ihrem Mechanismus unterscheiden oder ob nicht eventuell ein Proton während des O ® E Übergangs gepumpt wird (allerdings nur, wenn unmittelbar vorher die Sauerstoffreduktion durchlaufen wurde), sind u.a. noch intensivere Untersuchungen des P ® F Teilschrittes notwendig. Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin 2 verschiedene Kobaltkomplexe auf ihre Eignung als lichtinduzierbare Sauerstoffdonatoren (caged­Sauerstoff) für die COX untersucht. Hierbei stellte sich heraus, daß beide Verbindungen ungeeignet sind, da sie entweder instabil sind ((µ­superoxo)bis[pentaammincobalt(III)]) oder Nebenreaktionen mit dem Protein eingehen ((µ­peroxo)(µ­hydroxo)bis[bis(bipyridyl)cobalt(III)]). Abschließend wurde der Einfluß von Zn 2 ­Ionen auf elektrogene Schritte im katalytischen Zyklus genauer erforscht. Es wurde deutlich, daß Zn 2 bakterielle COX von beiden Seiten inhibieren kann, wobei die Bindestelle(n) auf der intrazellulären Seite im Gegensatz zur extrazellulären Seite hochaffin ist/sind. Die elektrischen Messungen deuten darauf hin, daß hierbei sowohl D­ als auch K­Weg blockiert werden, wobei die exakte Position der Metallbindestelle(n) noch zu klären ist

Which health research gets used and why? An empirical analysis of 30 cases

Background: While health research is considered essential for improving health worldwide, it remains unclear how it is best organized to contribute to health. This study examined research that was part of a Ghanaian-Dutch research program that aimed to increase the likelihood that results would be used by funding research that focused on national research priorities and was led by local researchers. The aim of this study was to map the contribution of this research to action and examine which features of research and translation processes were associated with the use of the results. Methods: Using Contribution Mapping, we systematically examined how 30 studies evolved and how results were used to contribute to action. We combined interviews with 113 purposively selected key informants, document analysis and triangulation to map how research and translation processes evolved and contributions to action were realized. After each case was analysed separately, a cross-case analysis was conducted to identify patterns in the association between features of research processes and the use of research. Results: The results of 20 of the 30 studies were used to contribute to action within 12 months. The priority setting and proposal selection process led to the funding of studies which were from the outset closely aligned with health sector priorities. Research was most likely to be used when it was initiated and conducted by people who were in a position to use their results in their own work. The results of 17 out of 18 of these user-initiated studies were translated into action. Other features of research that appeared to contribute to its use were involving potential key users in formulating proposals and developing recommendations. Conclusions: Our study underlines the importance of supporting research that meets locally-expressed needs and that is led by people embedded in the contexts in which results can be used. Supporting the involvement of health sector professionals in the design, conduct and interpretation of research appears to be an especially worthwhile investment

Verbetert paracetamol het herstel na een beroerte?

An increase in body temperature in the first days following stroke is related to poor functional outcome. High-dose paracetamol (acetaminophen) reduces the body temperature by 0.3°C and can prevent fever. Paracetamol treatment is simple, cheap and has few side effects. In the first "Paracetamol (Acetaminophen) in Stroke" (PAIS) study, there was a beneficial effect of high-dose paracetamol on functional outcome in patients with stroke and a body temperature of 37.0°C or above. Because this result was found in a subgroup analysis, a new study is needed to confirm this finding. Recently the randomised PAIS 2 study was initiated. This study aims to assess the effect of high-dose paracetamol on functional outcome in patients with acute stoke and a body temperature of 37.0°C or above.Een stijging van de lichaamstemperatuur in de eerste dagen na een beroerte is geassocieerd met een slechte prognose. Hoge dosis paracetamol verlaagt de lichaamstemperatuur gemiddeld met 0,3°C en kan koorts voorkómen. Behandeling met paracetamol is eenvoudig, zeer goedkoop en heeft weinig bijwerkingen. In het eerste ‘Paracetamol (Acetaminophen) in Stroke’(PAIS)-onderzoek verbeterde vroege behandeling met een hoge dosis paracetamol de functionele uitkomst van patiënten met een beroerte en een lichaamstemperatuur van 37,0°C of hoger. Dit effect werd echter gevonden in een subgroepanalyse en dient daarom nader te worden onderzocht. Recentelijk is het gerandomiseerde onderzoek PAIS 2 gestart. Hierin wordt het effect bestudeerd van behandeling met een hoge dosis paracetamol op functioneel herstel bij patiënten met een lichaamstemperatuur van 37,0°C of hoger in de acute fase van een beroerte

Criteria for inclusion of vaccinations in public programmes

As more and more new vaccines are developed and brought to the market, governments have to make decisions about which vaccinations to include in public programmes. This paper describes the experience in the Netherlands in developing a framework for assessing whether a vaccination should be included in the National Immunization Programme (NIP). Bearing in mind the public nature, the factors that determine a vaccine's suitability for inclusion in a communal vaccination programme have been translated into seven selection criteria, grouped under five thematic headings: seriousness and extent of the disease burden, effectiveness and safety of the vaccination, acceptability of the vaccination, efficiency of the vaccination, and priority of the vaccination. The seven criteria and the explanation of them provide a framework for the systematic examination of arguments for and against the inclusion and prioritisation of particular vaccinations. As an illustration, the vaccinations currently provided in the Netherlands through public programmes as well as 23 'candidate' vaccinations are assessed against the seven criteria. The proposed assessment framework including the selection criteria can take full account of the values and specificities as they may differ between situations and countries; the transparency of the approach may help to clarify which elements of the assessment are pivotal in specific situations. Using the criteria furthers a trustworthy, transparent and accountable process of decision-making about inclusion of new vaccinations in public vaccination programmes and may help to retain public confidence. © 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved

Single-electron reduction of the oxidized state is coupled to proton uptake via the K pathway in Paracoccus denitrificans cytochrome c oxidase

The reductive part of the catalytic cycle of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans was examined by using time-resolved potential measurements on black lipid membranes. Proteoliposomes were adsorbed to the black lipid membranes and Ru(II)(2,2′-bipyridyl)(3)(2+) was used as photoreductant to measure flash-induced membrane potential generation. Single-electron reduction of the oxidized wild-type cytochrome c oxidase reveals two phases of membrane potential generation (τ(1) ≈ 20 μs and τ(2) ≈ 175 μs) at pH 7.4. The fast phase is not sensitive to cyanide and is assigned to electron transfer from Cu(A) to heme a. The slower phase is inhibited completely by cyanide and shows a kinetic deuterium isotope effect by a factor of 2–3. Although two enzyme variants mutated in the so-called D pathway of proton transfer (D124N and E278Q) show the same time constants and relative amplitudes as the wild-type enzyme, in the K pathway variant K354M, τ(2) is increased to 900 μs. This result suggests uptake of a proton through the K pathway during the transition from the oxidized to the one-electron reduced state. After the second laser flash under anaerobic conditions, a third electrogenic phase with a time constant of ≈1 ms appears. The amplitude of this phase grows with increasing flash number. We explain this growth by injection of a second electron into the single-electron reduced enzyme. On multiple flashes, both D pathway mutants behave differently compared with the wild type and two additional slow phases of τ(3) ≈ 2 ms and τ(4) ≈ 15 ms are observed. These results suggest that the D pathway is involved in proton transfer coupled to the uptake of the second electron