Papel de la matriz extracelular en el ataque y defensa de bacillus en la interacción con plantas

En su ciclo de vida las bacterias se organizan en comunidades multicelulares, a las que se les ha dado el nombre de biofilms. La especie Bacillus subtilis está constituido por miembros no patógenos, y muchas cepas viven en asociación con plantas a las que proporciona una serie de beneficios: i) defensa frente al ataque de patógenos, ii) acceso a ciertos micronutrientes o iii) adaptación a ambientes estresantes. Además los estudios realizados con cepas de esta especie han contribuido a nuestro conocimiento sobre el programa de desarrollo que desemboca en el ensamblaje de los biofilms: i) las células se pegan a una superficie, ii) un proceso de diferenciación celular, y liii) a formación de la matriz extracelular. Estudios en nuestro laboratorio han demostrado que las rutas genéticas implicadas en la formación de biofilms son funcionales en la superficie de plantas. Los resultados obtenidos nos han permitido confirmar nuestra hipótesis, y además afinar en la contribución específica de cada componente a la multifuncionalidad de la matriz. La proteína amiloide TasA juega un doble papel, ensamblaje de la matriz y control del estado fisiológico de las bacterias, dos aspectos que afectan a la persistencia, colonización y antagonismo directo de Bacillus frente a P. xanthii. El polisacárido y la proteína hidrofóbica BslA son más esenciales en la defensa de Bacillus frente a otros competidores bacterianos que puede encontrar en la superficie vegetal, y con los que puede convivir de forma conjunta pero quizá no revuelta.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Extracellular matrix components are required to protect bacillus subtilis from pseudomonas invasion and co-colonization of plants

Plants are colonized by a vast variety of microbes. Among them, bacteria are the most predominant and are able to adapt to environmental changes and interact with other microorganisms using a wide array of molecules, metabolic plasticity and secretion systems. One way bacteria have evolved to succeed in this competitive scenario is the formation of biofilms which provides protection to the cells, modulates the flux of signals and controls cellular differentiation. Thus, efforts are encouraged to really determine the functionality of the bacterial extracellular matrix. In this study, we have employed microbiological and microscopic techniques to study the interaction between Bacillus subtilis 3610 and Pseudomonas chlororaphis PCL1606. We demonstrate the important role of the extracellular matrix in protecting B. subtilis colonies from infiltration by Pseudomonas. Furthermore, time-lapse confocal laser scanning microscopy (CLSM) analyses of the bacterial interactions have permitted to complete the study of the bacterial behaviors and to measure bacterial expansion rates. Surprising, we find that the Pseudomonas type VI secretion system (T6SS) is required in the cell-to-cell contact with matrix-impaired B. subtilis cells, revealing a novel role for T6SS against Gram-positive bacteria. In response to P. chlororaphis infiltration, we find that B. subtilis activates sporulation and expresses motility-related genes. Confocal microscopy of the bacterial interactions using plant organs highlights the functional importance of these different bacterial strategies in their coexistence as stable bacterial communities. The findings further our understanding of the functional role played by biofilms in mediating bacterial social interactions.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

A short version of the amyloid-like protein TasA fibrillates and supports biofilm formation in Bacillus cereus

The formation of bacterial biofilms is a doable thanks to the assembly of an extracellular matrix that provides to the entire community with i) an outstanding architectonic structure and ii) protection to the cells from external aggressions. In Bacillus subtilis, a structural element dedicated to the formation of the extracellular matrix is the amyloid-like protein TasA. To form fibers, TasA needs the participation of the protein TapA. Indeed, a tapA mutant resembles phenotypically to a tasA mutant, which is wrinkle-less pellicles or colonies with no distinguishable morphological features. tasA is widely spread within the Bacillus genus, but tapA is absent in the heterogeneous group of Bacillus cereus which includes environmental and pathogenic members; some of them are responsible for important food intoxication outbreaks. Then, we asked whether TasA would still retain functionality in biofilm formation in B. cereus. Comparative genomic analysis showed a region in B. cereus containing two orthologous of tasA, tasA and calY, and the orthologous of sipW, that encodes a signal peptidase. Our mutagenic studies revealed that the entire region was relevant for biofilm formation, and electron microscopy proved the major propensity of TasA than CalY to form fibers in the cell surfaces. These findings also indicated that in B. cereus as opposed to B. subtilis, an accessory TapA protein is not necessary for the fibrillation of TasA. Indeed, the heterologous expression of this region of B. cereus restored the capacity of a B. subtilis tasA operon mutant or a single tasA mutant to form pellicles. These pellicles stained with the amyloid dye Congo Red and the cells were decorated with fibers, both findings suggestive of an amyloid-like nature of the B. cereus TasA. Intriguingly, in a B. subtilis tapA mutant, only the entire region of B. cereus fully rescued pellicle formation, fibrillation or Congo Red staining, to a lesser extent did sipw-tasA, and no restoration was observed with sipW-calY. These observations led us to speculate that TapA might cross seed the fibrillation of TasA or CalY in B. subtilis. In summary, TasA is relevant for biofilm formation in these two bacterial species, which appears to be governed by its polymerizing nature. The fact that we count with two bacterial species containing versions of TasA with subtle differences will be of great value in our studies of the mechanistic of polymerization of these bacterial amyloid-like fibers and their contribution to the assembly of the extracellular matrix.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Impacto de la matriz extracelular de Bacillus subtilis en la respuesta fisiológica de cucurbitáceas

Las plantas viven en asociación con microorganismos, y han desarrollado estrategias para discriminar entre beneficiosos y patogénicos. Bacillus subtilis, agente de biocontrol en cucurbitáceas frente a patógenos como el oídio, es capaz de colonizar distintas superficies de las plantas, como las raíces o las hojas, mediante el establecimiento de comunidades bacterianas denominadas biopelículas o biofilms. Para establecerse en la parte aérea de las plantas, B. subtilis debe enfrentarse a condiciones ambientales adversas, como son los cambios de temperatura, el viento, la radiación solar y la reducida disponibilidad de nutrientes impuesta por la cutícula vegetal, lo que limita su colonización y crecimiento en dicha superficie. Por otro lado, Bacillus es capaz de influenciar el estado fisiológico de las plantas, promover su crecimiento o inducir una resistencia sistémica frente a patógenos. Para formar biofilms, Bacillus secreta una serie de compuestos, entre los que destaca la surfactina, que promueve el ensamblaje de una matriz extracelular en la que se embeben las células, cuyos componentes mayoritarios son proteínas (por ejemplo, las proteínas TasA y TapA, que forman fibras amiloides) y exopolisacáridos. Nuestro principal objetivo es determinar cómo el establecimiento de las comunidades de Bacillus afecta al estado fisiológico de las plantas, principalmente melón y pepino, y qué papel juegan los componentes de la matriz extracelular en la interacción con las plantas, así como los mecanismos por los cuales las plantas modulan la formación de dichas comunidades en la superficie de las hojas. El análisis de la respuesta de Arabidopsis y melón a distintos componentes de la matriz extracelular de B. subtilis sugiere que tanto la surfactina como los elementos mayoritarios de la matriz (las proteínas TasA y TapA, exopolisacáridos) activan mecanismos de señalización en ambas especies, que pueden promover el crecimiento de la planta o anticipar la defensa frente a patógenos.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tec

Interacción de aislados de Bacillus cereus responsables de toxoinfecciones alimentarias con la filosfera

Bacillus cereus es un grupo heterogéneo de bacterias Gram-positivas que incluyen cepas patógenas responsables de contaminaciones en la industria alimentaria y médica, así como intoxicaciones alimentarias. Dependiendo de los síntomas asociados a la intoxicación, las cepas patógenas de B. cereus pueden clasificarse en enterotoxigénicas y eméticas, existiendo también cepas ambientales con actividad de biocontrol. Además, esta bacteria forma biopelículas, lo que puede contribuir a una eficiente colonización de superficies incluidas las de plantas, un aspecto poco estudiado del ciclo de vida de B. cereus. En este trabajo se seleccionaron 10 aislados clínicos y ambientales de B. cereus, debido a las diferencias en su capacidad para formar biopelículas in vitro. Para estudiar la ecología de estas cepas, se inocularon hojas de plantas de melón y pepino con suspensiones de 108 ufc/ml de cada cepa. La dinámica de población demostró que prácticamente todos los aislados persistían en las hojas a niveles de 103 ufc/g de hoja, aunque no parecía existir un patrón asociado al origen del aislamiento. Sin embargo, pudimos observar tres cinéticas de esporulación diferentes: esporulación temprana de la población, esporulación tardía y prácticamente ausencia de esporulación. El seguimiento de la distribución espacial de las bacterias mediante microscopía electrónica de barrido mostró la existencia de colonias formadas por varias capas de células unidas entre sí por una especie de matriz, sugerente de biopelículas bacterianas. Nuestros resultados prevén la capacidad de cepas patógenas de humanos de B. cereus de vivir en la filosfera de plantas como lo haría una cepa de origen ambiental, usando para ello la formación de biopelículas, la esporulación o una combinación de ambas estrategias. Si bien, las hojas de las plantas ensayadas no entrarían en la cadena alimenticia del hombre, si representarían un reservorio importante desde donde podrían pasar a los frutos que se consumen.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Evaluación de la capacidad nematicida de los agentes de biocontrol UMAF6614 y UMAF6639

Los nematodos fitoparásitos son uno de los grupos de patógenos de cultivos más destructivos causando graves pérdidas anuales a nivel mundial. La mayoría de los nematodos fitoparásitos se localizan en el suelo siendo patógenos de la raíz, lo que implica una gran dificultad en cuanto a su control y erradicación. Hoy en día, la aplicación de agentes químicos sigue siendo el método más común para la gestión y control de estos patógenos. Sin embargo, debido a la crecientes preocupaciones sobre los problemas de seguridad del medio ambiente y salud pública, muchos nematicidas químicos con alto grado de toxicidad se han retirado o se ha restringido su uso. Por tanto, urge desarrollar alternativas ecológicas para el control de estos patógenos. El empleo de bacterias beneficiosas para combatir plagas o enfermedades de plantas ha cobrado gran importancia en las últimas décadas. Entre las diferentes especies microbianas estudiadas, los miembros del género Bacillus se han demostrado eficaces para su uso como agentes de control biológico. En un estudios previos, se demostró que las cepas de Bacillus amyloliquefaciens, UMAF6614 y UMAF6639, son excelentes candidatas como agentes de biocontrol contra enfermedades fúngicas y bacterianas de las cucurbitáceas. Tras realizar los ensayos de mortalidad se ha visto que estas cepas tienen actividad nematicida pero se desconoce cuáles son los factores que median esta actividad y el modo de acción de dichos factores. Por tanto, en este trabajo se integran técnicas de química analítica y aproximaciones genómicas para identificar los compuestos responsables de dicha actividad y regiones en el genoma que codifiquen compuestos con actividad nematicida

Análisis funcional de efectores candidatos de Podosphaera xanthii: la vía para descubrir nuevas dianas para fungicidas en oídios

Los oídios son patógenos biotrofos obligados que requieren las células vivas de su hospedador para completar su ciclo de vida asexual. Estos patógenos desarrollan una estructura especializada responsable de la absorción de nutrientes y del intercambio de factores con la planta denominada 'haustorio'. Estos factores son los denominados efectores, pequeñas proteínas secretadas responsables de inhibir y modificar la respuesta de defensa de la planta. Algunos de estos efectores desempeñan papeles importantes en el desarrollo del hongo, incluso algunos son esenciales para la infección. Recientemente hemos secuenciado y anotado el transcriptoma epifítico de Podosphaera xanthii, principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas en el sur de España, y hemos identificado 119 efectores candidatos (ECP). El objetivo de este trabajo es identificar los verdaderos efectores de P. xanthii que tienen un papel importante en la interacción planta-hongo patógeno y diseñar nuevos fungicidas para inhibir su funcionalidad. Materiales y métodos: A partir del transcriptoma epifítico, se analizaron tres efectores candidatos mediante silenciamiento génico inducido por el hospedador (HIGS) y la sobreexpresión de dichos efectores en cotiledones de melón, utilizando para ello el método de agroinfiltración. Posteriormente, se examinó la inducción de la respuesta de defensa en planta mediante la detección histoquímica de especies reactivas de oxígeno y la acumulación de depósitos de calosa, así como los cambios en el desarrollo del hongo.El silenciamiento de los tres efectores analizados provocó una respuesta de defensa de la planta, observándose diferencias en la acumulación de peróxido de hidrógeno (H2O2) y calosa, lo que sugiere la diferente implicación de estos efectores en la infección. En concreto, el efector ECP2707 parece interferir específicamente con la formación de la papila, primera barrera de defensa de la planta, impidiendo o ralentizando la penetración en la célula vegetal. El silenciamiento del efector ECP5191 dio lugar al aumento del número de células que acumulaban H2O2 y calosa, así como una disminución en el número de puntos de penetración del hongo, observándose todo lo contrario cuando se sobreexpresa dicho efector. El silenciamiento del efector ECP6385 se tradujo en la completa inhibición de la infección, mostrándose una respuesta similar a la producida en las plantas resistentes: una fuerte acumulación de H2O2 y calosa en los puntos de penetración. Además, la fusión traduccional ECP5191-GFP ha permitido localizar este efector de P. xanthii en los puntos de penetración y vesículas del haustorio del hongo. Tras los resultados obtenidos, podemos concluir que esta metodología puede ser útil para la identificación de efectores de P. xanthii con un papel en la patogénesis. Además, en el caso de ECP6385, los resultados sugieren que sería una buena diana para el desarrollo de nuevos fungicidas.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Este trabajo ha sido financiado por ayudas del Plan Nacional de I+D+I del anterior Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) (AGL2013-41939-R), cofinanciado con fondos FEDER (UE

Identificación de una familia de quitinasas de Podosphaera xanthii implicadas en las manipulación de la inmunidad disparada por quitina

Los oídios son patógenos biotrofos obligados que requieren células vivas para completar su ciclo de vida, por lo que deben eludir o inhibir las respuestas de defensa de la planta mediante la secreción de efectores. El haustorio, estructura del hongo especializada en la toma de nutrientes, es también la vía de intercambio de factores con las células huésped. Hasta la fecha, son muy numerosos los efectores identificados en diversos hongos fitopatógenos, sin embargo, es poco lo conocido acerca de los efectores de oídios. En este trabajo hemos desarrollado un método para el análisis de efectores candidatos de Podosphaera xanthii (ECP), agente causal del oídio de las cucurbitáceas, mediante el silenciamiento génico inducido por el hospedador (HIGS) en cotiledones de melón, utilizando para ello Agrobacterium tumefaciens. El silenciamiento de efectores candidatos provocó diferente respuesta de defensa en planta, observándose diferencias en la acumulación de H2O2, lo que sugiere la diferente implicación de estos efectores en la infección. Además, la activación de la respuesta en planta se tradujo en un efecto negativo sobre el desarrollo del hongo. En paralelo, se realizó el modelado y el análisis informático de los efectores. En especial destacan los efectores ECHA, cuyo modelo muestra homología con quitinasas. Los análisis in vitro validaron la actividad predicha de estos efectores. Además, el doble silenciamiento de efectores ECHA y el receptor de quitina de melón CERK1, muestra que estos efectores modulan la inmunidad disparada por el reconocimiento de quitina. Mediante la fusión traduccional ECP5191-GFP (efector ECHA), se han localizado estos efectores en los puntos de penetración, lugar donde se acumula gran cantidad de quitina. Tras los resultados obtenidos, podemos concluir los efectores ECHA constituyen una familia de quitinasas con papel en la patogénesis. Además, los resultados confirman que esta metodología es útil para la identificación de efectores de P. xanthii. Este trabajo ha sido financiado por ayudas del Plan Nacional de I+D+I del Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-41939-R), cofinanciado con fondos FEDER (UE).Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Interacción del patógeno humano Bacillus cereus con plantas de interés agronómico

Uno de los grandes retos de la industria agroalimentaria es reducir los continuos casos de intoxicaciones alimentarias causadas por el consumo de frutas y verduras contaminadas con patógenos de humanos, y las consecuentes pérdidas económicas. Bacillus cereus es una bacteria patógena de humanos responsable de intoxicaciones alimentarias que en ocasiones pueden ser letales. El ciclo de vida de esta bacteria se caracteriza por la formación de biopelículas y la esporulación. Las biopelículas son comunidades de bacterias difíciles de erradicar, y para su formación las bacterias ensamblan una matriz extracelular formada principalmente por exopolisacáridos y proteínas. En este trabajo, nos planteamos estudiar las bases moleculares que dirigen la formación de biopelículas en B. cereus, y su posible implicación en la interacción con diferentes plantas hortofrutícolas. Para ello, nos hemos centrado en el análisis de los componentes estructurales de la matriz extracelular, y más concretamente en posibles adhesinas de naturaleza proteica. B. cereus tiene dos ortólogos del gen tasa de B. subtilis que codifica para una proteína que polimeriza en la forma de fibras amiloides y es indispensable para la formación de las biopelículas. Mediante estudios de expresión heteróloga demostramos que el alelo de tasA de B. cereus rescata la formación de biopelículas de una cepa de B. subtilis que carece de su propio tasA. De la misma forma, un mutante de B. cereus en este alelo presenta un fenotipo defectuoso en la formación de biopelículas tanto in vitro como en la interacción con plantas. Finalmente estudios bioquímicos y morfológicos preliminares de esta proteína apuntan a su naturaleza tipo amiloide como su ortólogo de B. subtilis.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Podosphaera fusca

Comunicación presentada en formato panel en la sesión "Microbial pathogenesis"The powdery mildews are obligate biotrophic pathogens that depend on living plant cells to complete its life cycle. These pathogens develop a specialized structure called haustorium that serves for nutrient uptake and exchange of factors with the plant. Thus, great interest has been focused on understanding how they are assembled and how they mediate fungus-plant communication. A bottleneck in these studies is the difficulty to manipulate genetically this group of fungi, and indeed transformation of powdery mildew fungi remains elusive to researchers. In this work, we show the genetic manipulation of the cucurbit powdery mildew pathogen Podosphaera fusca using Agrobacterium-mediated transformation. Using this method, we obtained stable transformants for a variety of constructs: i) a plasmid expressing the egfp gene under the control of a constitutive promoter from Aspergilus nidulans, ii) plasmids expressing the hygromycin resistance cassette or a β-tubulin allele that confers resistance to carbendazim, a MBC fungicide. Moreover, we performed fluorescence microscopy studies with a translational fusion of CSEP5191, a candidate effector of P. fusca, fused to GFP, and found how this candidate effector is localized into large vesicles of the haustorium. These results support the feasibility of this transformation method to manipulate genetically P. fusca and open the possibility to be used with other powdery mildews.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Plan Nacional Plan I+D+I del antiguo MInisterio de Ciencia e Innovación (AGL2010-21848-CO2-01), cofinanciado con fondos FEDER funds (UE)