Decoupling filamentous phage uptake and energy of the TolQRA motor in Escherichia coli .

International audienceFilamentous phages are non-lytic viruses that specifically infect bacteria, establishing a persistent association with their host. The phage particle has no machinery for generating energy and parasitizes its host existing structures in order to cross the bacterial envelope and deliver its genetic material. The import of filamentous phages across the bacterial periplasmic space requires some of the components of a macro-complex of the envelope known as the Tol system. This complex uses the energy provided by the proton-motive force of the inner membrane to perform essential and highly energy-consuming functions of the cell, such as envelope integrity maintenance and cell division. It has been suggested that phages take advantage of pmf-driven conformational changes in the Tol system to transit across the periplasm. However, this hypothesis has not been formally tested. In order to decouple the role of the Tol system in cell physiology and during phage parasitism, we used mutations on conserved essential residues known for inactivating pmf-dependent functions of the Tol system. We identified impaired Tol complexes that remain fully efficient for filamentous phage uptake. We further demonstrate that the TolQ-TolR homologous motor, ExbB-ExbD, normally operating with the TonB protein, is able to promote phage infection along with full length TolA

Sequence nucleotidique et etude de la transcription des genes de la colicine A, de la proteine d'immunite et de la proteine de lyse du plasmide col A

SIGLECNRS T 55968 / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueFRFranc

Le système Tol/Pal d'Escherichia coli (Rôle de la protéine ToIR dans le maintien de l'intégrité de la membrane externe et dans l'importation des colicines)

AIX-MARSEILLE2-BU Sci.Luminy (130552106) / SudocSudocFranceF

Le système Tol-Pal (l'intégrité membranaire et les interactions entre TolA, colicine A et G3p, protéine de capside des phages filamenteux)

AIX-MARSEILLE2-BU Sci.Luminy (130552106) / SudocSudocFranceF

Le Complexe membranaire Tol d'Escherichia coli (un modèle pour l'étude de l'organisation fonctionnelle d'un moteur moléculaire bactérien)

Le système protéique Tol-Pal est conservé chez les bactéries à Gram négatif. Chaque mutant tol ou pal provoque une déstabilisation de la membrane externe (ME). Les protéines TolA-Q-R forment un complexe de membrane interne (MI) ; Pal ancrée dans la ME interagit avec le peptidoglycane et la protéine périplasmique TolB. L interaction entre TolA et Pal dépend de TolQ-R et de la force proton-motrice (fpm). Les protéines TolA-Q-R relient ainsi MI, ME et le peptidoglycane. Le but de ce projet est de comprendre l organisation des segments transmembranaires (sTM) de TolQ-R et le mécanisme énergétique. Les interactions entre sTM ont été analysées ainsi que les résidus impliqués dans le passage d ions. Nous avons montré que le domaine C-terminal de TolR est dynamique en réponse à la fpm. Nous avons entrepris une mutagénèse systématique de chacun des résidus des sTM. Les résultats obtenus ont permis de dresser un modèle dynamique de l organisation des sTM du complexe TolQ-R.The Tol-Pal system is well conserved in Gram negative bacteria. Each of the tol- pal mutant exhibits outer membrane (OM) defects. The TolQ-R-A proteins form an inner membrane (IM) complex; Pal anchored in the OM interacts with the peptidoglycan and the periplasmic protein TolB. The TolA-Pal interaction depends on TolQ-R and on the proton motive force (pmf). The TolQ-R-A proteins may form a molecular motor using the pmf to link IM, OM and the peptidoglycan. The aim of this work is to understand the organisation of the IM TolQ-R proteins and the utilisation of pmf. Using mutagenesis approaches, we defined helix organization and key residues of the putative ion channel. We demonstrated movements of the C-terminus of TolR dependent on the pmf. To define complex organisation and conformational changes of the transmembrane segments (TMs), we performed a cysteine scanning mutagenesis. Our results suggest a dynamic model of the TolQ-R TMs organisation.AIX-MARSEILLE2-BU Sci.Luminy (130552106) / SudocSudocFranceF

Etude fonctionnelle d'un moteur moléculaire bactérien (l'exemple du complexe TolQRA d'Escherichia coli)

AIX-MARSEILLE2-BU Sci.Luminy (130552106) / SudocSudocFranceF

Mécanisme d'importation des colicines (détournement des fonctions physiologiques des protéines FtsH et FkpA)

Les colicines sont des toxines protéiques sécrétées par Escherichia coli ou des espèces apparentées. Leur mécanisme d'action se décompose en plusieurs étapes impliquant des domaines structurellement distincts de la toxine : le domaine central interagit avec un récepteur spécifique de membrane externe, le domaine N-terminal est transloqué à travers la membrane externe via un translocateur, puis transite dans le périplasme et le domaine C-terminal porte l activité létale. L étape de transit des colicines dites du groupe A implique l'interaction du domaine N-terminal de la colicine avec les protéines du système Tol. Ce système est formé de cinq protéines : TolQ, TolR, TolA, TolB et Pal. Le système TonB, composé des protéines TonB, ExbB et ExbD, est quant à lui parasité par les colicines dites du groupe B. La combinaison de techniques in vivo et in vitro, nous a permis de mettre en évidence pour la première fois l interaction d une colicine avec la protéine TolQ. Nous avons également montré que le clivage protéolytique de la protéine TolA, une protéine clé du système Tol, contrôle les interactions séquentielles engagées entre les colicines du groupe A et les composants de leur machinerie d import chez E. coli. La colicine interagit avec TolB, puis TolA et finalement avec TolR et/ou TolQ. Nous avons également pu attribuer un rôle à la protéase FtsH dans ce mécanisme de dégradation. Parallèlement, nous avons entrepris de caractériser la colicine TonB-dépendante appelée colicine M (ColM), la seule colicine connue à ce jour capable de perturber la synthèse de peptidoglycane et dont l activité nécessite la présence de la protéine périplasmique FkpA, un chaperon possédant une activité peptidyl-prolyl isomérase. Nous avons proposé une nouvelle approche pour étudier la ColM et délimiter plus précisément ses domaines afin d identifier la séquence minimale requise pour sa toxicité. Nous avons montré que dans E. coli, la production périplasmique de la ColM (sp-ColM) est toxique et que son activité dépend de FkpA. Le domaine minimal requis pour cette toxicité correspond aux 153 derniers acides aminés C-terminaux deColM. Contrairement à la ColM entière, la toxicité de ce domaine C-terminal dans le périplasme d E. coline requiert pas FkpA.L ensemble des données montrent que les colicines sont capables de parasiter des systèmes bactériens pour pénétrer dans la cellule et aussi de détourner la fonction physiologique de certaines protéines pour atteindre leurs cibles.Colicins are toxin proteins secreted by Escherichia coli or related bacteria species. The actionmechanism of the colicins can be divided into several steps that involve distinct structural domains: thebinding of its central domain to an outer membrane specific receptor, the translocation of its N-terminaldomain through the outer membrane, the transit of this same domain through the periplasm and the lethalactivity carried by the C-terminal domain. The transit step of the group A colicins requires the interactionof colicin N-terminal domain with the Tol system which is composed of five proteins: TolQ, TolR, TolA,TolB and Pal. The TonB system, composed of TonB, ExbB and ExbD, is parasitized by the group Bcolicins. Using a combination of in vitro and in vivo experiments, we identified for the first time aninteraction between a colicin and the TolQ protein. We have also shown that the proteolytic cleavage ofthe TolA protein, a key protein of the Tol system, controls the sequential interactions of the group Acolicins with the components of their import machinery in E. Coli and we assigned a role to FtsH proteasein this degradation mechanism. We defined that the colicin interacts first with the TolB protein, then withTolA, and finally with TolR and/or TolQ.In parallel, we undertook the characterization of the TonB-dependent colicin M (ColM), the only colicinknown to be able to disrupt the peptidoglycan synthesis and that requires for its toxic activity the presenceof FkpA, a chaperone and peptidyl propyl isomerase protein located in the periplasm. We proposed a newapproach to investigate the in vivo activity of ColM designed to identify the different domains of ColMand the minimal sequence that retains toxic activity. We have shown that in E. coli, the periplasmicproduction of ColM is toxic and that its activity is FkpA dependent. The minimal domain required fortoxicity corresponds to the C-terminal last 153 amino acids of ColM. Unlike the full-length protein, thisdomain produced in the E. coli periplasm does not require FkpA for toxic activity.All these data show that colicins are able to parasitize bacterial systems to enter the cell and also to divertthe physiological function of certain proteins to achieve their targetsAIX-MARSEILLE2-Bib.electronique (130559901) / SudocSudocFranceF

Import des macromelecules (analyses structurales de la toxine bactérienne pesticine et d'un derive hybride)

Chez les bactéries à Gram-négatif, deux systèmes très bien conservés et essentiels à la survie de la cellule bactérienne ont été identifiés : les systèmes Tol et TonB. Ces deux systèmes utilisent la force proton motrice, issue de la membrane interne et transfert l énergie associée pour le transport actif de molécules (TonB) ou nécessaire au maintien de l intégrité membranaire (Tol). Ces 2 systèmes ont été détournés de leurs fonctions initiales et parasités par les colicines, leur conférant un rôle primordial dans le mécanisme d import de la colicine. Une colicine est une bactériocine (toxine) produite par Escherichia coli pour tuer des souches apparentées. Ce sont des toxines spécifiques et hautement actives. Cependant E.coli a développé des mécanismes de protection afin de résister à l action cytotoxique des colicines. Ces mécanismes de résistance consistent essentiellement à produire des protéines d immunité, qui vont pour la plupart se fixer sur le domaine catalytique de la colicine et l empêcher d exercer son action létale. La bactérie Yersinia pestis, agent de la peste, possède une colicin-like bactériocine, la pesticine, dont l activité est de dégrader le peptidoglycane. L action de la pesticine est inhibée par une protéine d immunité, Pim, localisée dans le périplasme. Le principal objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes d inhibition de la pesticine par sa protéine d immunité, grâce à des données biochimiques et structurales, mais aussi d apporter des solutions pour contourner ce problème de résistance. La structure de la pesticine révèle des homologies structurales avec le T4 lysozyme du bactériophage T4. Pour contourner le problème de la résistance bactérienne liée à la protéine d immunité, une solution a été de fusionner le domaine de réception/translocation de la pesticine avec le T4 lysozyme. Nous avons ainsi pu créer et résoudre la structure tridimensionnelle d une protéine chimère fonctionnelle, capable de se fixer sur FyuA (récepteur de la pesticine) et tuer une souche exprimant ce récepteur et dont l activité létale n est pas inhibée par Pim.In Gram-negative bacteria, two essential systems for cell survival have been characterized: the Tol and TonB system. Both Ton and Tol systems are very well conserved in Gram-negative bacteria and coupled to the proton motive force across the inner membrane, acting as energy transducers for active transport (Ton) or maintenance of outer envelope integrity (Tol). Both systems have been embezzled from their primary function and hijacked by colicins as part of the colicin killing pathway. Colicin is a bacteriocin (toxin) produced by and toxic to some strains of Escherichia coli. Colicins are highly effective toxins. However E.coli could develop protective mechanisms to resist to colicin cytotoxic effect. These mechanisms essentially consist to produce an immunity protein. These proteins bind to colicin catalytic domain and inhibit its lethal activity. Yersinia pestis, plague agent, possesses its own colicin-like bacteriocin, Pesticin, which degrades murein. Pesticin activity is inhibited by an immunity protein, Pim, localized in the periplasm. The main goal of this project is to understand inhibition mechanisms between Pim and Pesticin by biochemical and structural data and to provide solution to overcome the resistance issue, since Pesticin was thought to be used as antimicrobial agent. The Pesticin structure has revealed that Pesticin share structural homologies with the T4 lysozyme from the bacteriophage T4. To overcome the resistance issue due to the immunity protein, one solution has been to fuse the Pesticin binding/translocation domain with the T4 lysozyme. Thus, we could engineered and solved the three-dimensional structure of a chimera protein, able to bind FyuA (Pesticin physiological receptor) and kill a FyuA expressing strain, in which the lethal activity is not affected by Pim.AIX-MARSEILLE2-Bib.electronique (130559901) / SudocSudocFranceF

Immunity Protein Protects Colicin E2 from OmpT Protease

International audienceThe endonuclease colicin E2 (ColE2), a bacteriocidal protein, and the associated cognate immunity protein (Im2) are released from producing Escherichia coli cells. ColE2 interaction with the target cell outer membrane BtuB protein and Tol import machinery allows the dissociation of Im2 from its colicin at the outer membrane surface. Here, we use in vivo approaches to show that a small amount of ColE2-Im2 protein complex bound to sensitive cells is susceptible to proteolytic cleavage by the outer membrane protease, OmpT. The presence of BtuB is required for ColE-Im2 cleavage by OmpT. The amount of colicin cleaved by OmpT is greatly enhanced when ColE2 is dissociated from Im2. We further demonstrate that OmpT cleaves the C-terminal DNase domain of the toxin. As expected, strains that over-produce OmpT are less susceptible to infection by ColE2 than by ColE2-Im2. Our findings reveal an additional function for the immunity protein beside protection of producing cells against their own colicin in the cytoplasm. Im2 protects ColE2 against OmpT-mediated proteolytic attack

Import des macromolecules (analyses structurales de la toxine bacterienne pesticine et d'une dérivé hybride)

Chez les bactéries à Gram-négatif, deux systèmes très bien conservés et essentiels à la survie de la cellule bactérienne ont été identifiés : les systèmes Tol et TonB. Ces deux systèmes utilisent la force proton motrice, issue de la membrane interne et transfert l énergie associée pour le transport actif de molécules (TonB) ou nécessaire au maintien de l intégrité membranaire (Tol). Ces 2 systèmes ont été détournés de leurs fonctions initiales et parasités par les colicines, leur conférant un rôle primordial dans le mécanisme d import de la colicine. Une colicine est une bactériocine (toxine) produite par Escherichia coli pour tuer des souches apparentées. Ce sont des toxines spécifiques et hautement actives. Cependant E.coli a développé des mécanismes de protection afin de résister à l action cytotoxique des colicines. Ces mécanismes de résistance consistent essentiellement à produire des protéines d immunité, qui vont pour la plupart se fixer sur le domaine catalytique de la colicine et l empêcher d exercer son action létale. La bactérie Yersinia pestis, agent de la peste, possède une colicin-like bactériocine, la pesticine, dont l activité est de dégrader le peptidoglycane. L action de la pesticine est inhibée par une protéine d immunité, Pim, localisée dans le périplasme. Le principal objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes d inhibition de la pesticine par sa protéine d immunité, grâce à des données biochimiques et structurales, mais aussi d apporter des solutions pour contourner ce problème de résistance. La structure de la pesticine révèle des homologies structurales avec le T4 lysozyme du bactériophage T4. Pour contourner le problème de la résistance bactérienne liée à la protéine d immunité, une solution a été de fusionner le domaine de réception/translocation de la pesticine avec le T4 lysozyme. Nous avons ainsi pu créer et résoudre la structure tridimensionnelle d une protéine chimère fonctionnelle, capable de se fixer sur FyuA (récepteur de la pesticine) et tuer une souche exprimant ce récepteur et dont l activité létale n est pas inhibée par Pim.In Gram-negative bacteria, two essential systems for cell survival have been characterized: the Tol and TonB system. Both Ton and Tol systems are very well conserved in Gram-negative bacteria and coupled to the proton motive force across the inner membrane, acting as energy transducers for active transport (Ton) or maintenance of outer envelope integrity (Tol). Both systems have been embezzled from their primary function and hijacked by colicins as part of the colicin killing pathway. Colicin is a bacteriocin (toxin) produced by and toxic to some strains of Escherichia coli. Colicins are highly effective toxins. However E.coli could develop protective mechanisms to resist to colicin cytotoxic effect. These mechanisms essentially consist to produce an immunity protein. These proteins bind to colicin catalytic domain and inhibit its lethal activity. Yersinia pestis, plague agent, possesses its own colicin-like bacteriocin, Pesticin, which degrades murein. Pesticin activity is inhibited by an immunity protein, Pim, localized in the periplasm. The main goal of this project is to understand inhibition mechanisms between Pim and Pesticin by biochemical and structural data and to provide solution to overcome the resistance issue, since Pesticin was thought to be used as antimicrobial agent. The Pesticin structure has revealed that Pesticin share structural homologies with the T4 lysozyme from the bacteriophage T4. To overcome the resistance issue due to the immunity protein, one solution has been to fuse the Pesticin binding/translocation domain with the T4 lysozyme. Thus, we could engineered and solved the three-dimensional structure of a chimera protein, able to bind FyuA (Pesticin physiological receptor) and kill a FyuA expressing strain, in which the lethal activity is not affected by Pim.AIX-MARSEILLE2-BU Sci.Luminy (130552106) / SudocSudocFranceF