Cloning and expression of an Aeromonas hydrophila chitinase gene in escherichia coli

The gene encoding an extracellular chitinase from Aeromonas hydrophila has been cloned and expressed in Escherichia coli. Plasmid pJP2512 contained the smallest DNA insert (3.9 kb) producing chitinase. The chitinase gene is transcribed from its own promoter, producing a protein of Mr 96,000. The chitinase open reading frame, an estimated 2.6 kb in length, has been subcloned to a 3.0 kb fragment; however, this fragment does not carry the functional chitinase promoter. In E. coli the chitinase enzyme is unable to transverse the outer membrane, being secreted across the cytoplasmic membrane and accumulating in the periplasmic space

Cloning of a chitinase gene from Ewingella americana, a pathogen of the cultivated mushroom, Agaricus bisporus

We have isolated a gene encoding a chitinase (EC 3.2.1.14) from Ewingella americana, a recently described pathogen of the mushroom Agaricus bisporus. This gene, designated chiA (EMBL/Genbank/DDBJ accession number X90562), was cloned by expression screening of a plasmid-based E. americana HindIII genomic library in Escherichia coli using remazol brilliant violet-stained carboxymethylated chitin incorporated into selective medium. The chiA gene has a 918-bp ORF, terminated by a TAA codon, with a calculated polypeptide size of 33.2 kDa, likely corresponding to a previously purified and characterised 33-kDa endochitinase from E. americana. The deduced amino acid sequence shares 33% identity with chitinase II from Aeromonas sp. No. 10S-24 and 7.8% identity with a chitinase from Saccharopolyspora erythraeus. Homology to other chitinase sequences was otherwise low. The peptide sequence deduced from chiA lacks a typical N-terminal signal sequence and also lacks the chitin binding and type III fibronectin homology units common to many bacterial chitinases. The possibility that this chitinase is not primarily adapted for the environmental mineralisation of pre-formed chitin, but rather for the breakdown of nascent chitin, is discussed in the context of mushroom disease.<br>O gene que codifica uma quitinase (EC 3.2.1.14) foi isolado de Ewingella americana, recentemente descrita como patógeno do cogumelo Agaricus bisporus. Este gene, denominado chiA (EMBL/Genebank/DDBJ número de acesso X9061), foi clonado e selecionado a partir de livraria genômica construída por digestão do DNA de E. americana com HindIII e ligação em plasmídio de expressão em E. coli, utilizando meio seletivo contendo quitina carboximetilada, corada com "remazol brilliant violet'' para seleção de clones. O gene chiA apresenta uma ORF de 918 bp, código terminador TAA, tendo o tamanho do polipeptídeo sido calculado como 33,2 kDa, o qual corresponde ao tamanho de 33 kDa da endoquitinase previamente purificada de E. americana. A seqüência deduzida de aminoácidos apresenta 33% de identidade com a quitinase II de Aeromonas sp. No. 10S-24 e 7,8% de identidade com quitinase de Saccharopolyspora erythraeus. Baixa homologia com outras quitinases foi observada. A seqüência deduzida de aminoácidos de chiA não apresenta sinal típico de N-terminal e também não apresenta típico sítio de ligação com quitina nem unidades de homologia à fibronectina do tipo III, comuns a muitas quitinases bacterianas. Existe a possibilidade de que esta quitinase não seja primariamente adaptada para mineralização de quitina pré-formada no ambiente, sendo discutida a digestão e quebra de quitina nascente, no contexto de doenças de cogumelos