A study of iNOS and TNF-a participation in the evolution of experimental autoimmune neuritis in Lewis rats

Orientadores: Francesco Langone, Leonilda Maria Barbosa dos SantosTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A isoforma induzível da sintase do óxido nítrico (iNOS) e o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-a) estão envolvidos em processos inflamatórios desmielinizantes como a síndrome de Guillain Barré e seu modelo animal, a neurite experimental auto-imune (EAN). A presença dessas moléculas foi investigada no sistema nervoso periférico de ratos Lewis em diferentes fases da EAN. Raízes nervosas oriundas dos segmentos medulares torácico 12 (T12) a lombar 3 (L3) (raízes adjacentes à intumescência lombar), cauda eqüina e nervos ciáticos foram coletados e processados para dupla imunofluorescência. Paralelamente, esses espécimes foram analisados quanto à desmielinização e degeneração axonal, por meio de histoquímica de Sudan Black e imunofluorescência para neurofilamentos, respectivamente. Todos os animais com EAN apresentaram células inflamatórias com imunorreatividade para iNOS e TNF-a, correspondendo a macrófagos e polimorfonucleares (neutrófilos). Essas células contendo iNOS e TNF-a foram observadas nos ratos Lewis exibindo os primeiros sinais clínicos da EAN. Sua população tornou-se numerosa durante a fase de agravamento do quadro clínico, diminuiu no decorrer da fase de recuperação e não foi observada nos animais clinicamente recuperados. Conforme o estágio da EAN, essas células contendo iNOS e TNF-a foram encontradas nas diferentes regiões nervosas analisadas. No início dos sinais clínicos observou-se algumas células iNOS/TNF-a-imunorreativas em vasos da cauda eqüina e do nervo ciático. Na fase em que os animais apresentaram paraparesia, houve um aumento dessa população celular ao redor de vasos e infiltrados inflamatórios nos gânglios sensitivos, na cauda eqüina e nas raízes nervosas T12-L3. Alterações na bainha de mielina e nos neurofilamentos não foram detectadas. Com a evolução da EAN, os animais desenvolveram paraparesia severa. Nesta fase, numerosas células com imunorreatividade para iNOS e TNF-a distribuíram-se ao redor de infiltrados inflamatórios e no tecido endoneural das raízes espinhais e do nervo ciático. Próximo às regiões de infiltrado, algumas fibras nervosas apresentaram bainha de mielina fragmentada ou mais delgada. Alguns axônios no nervo ciático exibiram imunomarcação dos neurofilamentos menos intensa, fragmentada ou aglomerada. Na fase de recuperação, raras células iNOS/TNF-a-imunorreativas foram encontradas em vasos das raízes nervosas T12-L3 e do nervo ciático. Em algumas raízes da cauda eqüina, essas células foram observadas em maior número. O auge da desmielinização foi verificado no nervo ciático nesse estágio, com a presença de vários fragmentos e ovóides de mielina. Os neurofilamentos imunomarcados, por sua vez, apresentaram-se contínuos, porém mais delgados do que os normais. Na fase de resolução da EAN não foram evidenciadas células duplamente imunorreativas. A bainha de mielina recobrou seu aspecto normal nas raízes nervosas, enquanto que no nervo ciático, bainhas de mielina e neurofilamentos imunomarcados delgados foram observados em meio a bainhas e imunomarcação de neurofilamentos mais grossas. Nossos resultados sugerem uma correlação entre a presença da iNOS e TNF-a nas diferentes regiões nervosas e os sinais clínicos exibidos pelo animal com EAN. Além disso, o acentuado processo desmielinizante que ocorre no nervo ciático é capaz de promover alterações estruturais nos neurofilamentos, provavelmente afetando o funcionamento normal dos axôniosAbstract:Inducible nitric oxide synthase (iNOS) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) are involved in inflammatory processes such as Guillain Barré Syndrome and its animal model, Experimental Autoimmune Neuritis (EAN). In this study, the presence of these molecules was investigated in the peripheral nervous systems of Lewis rats at different stages of EAN. Thoracic 12 (T12) to lumbar 3 (L3) spinal roots adjacent to lumbar intumescence, cauda equina and sciatic nerves were obtained and processed for double immunofluorescence. These specimens were also analyzed for myelin and axonal degeneration using Sudan Black histochemistry and neurofilament immunolabelling, respectively. All the immunized animals showed double iNOS and TNF-a immunoreactivity in inflammatory cells such as macrophages and polymorphonuclears (neutrophils). These cells were observed in Lewis rats exhibiting the first clinical signs of EAN. Their population increased during the worsening of the disease, diminished during the recovery phase and had disappeared completely in clinically recovered rats. Depending on the EAN phase, iNOS and TNF-a bearing cells were found in the different regions of peripheral nervous system analyzed. At the onset of clinical signs, some iNOS and TNF-a immunoreactive cells were observed in vessels of the cauda equina and the sciatic nerve. In mildly paraparetic rats, an increase in the amount of these cells around vessels and inflammatory infiltrates in the dorsal root ganglia, cauda equina and T12-L3 spinal roots was observed. Changes in the myelin sheath and neurofilaments were not detected. As the EAN evolved, the rats developed severe paraparesis. At this stage, numerous iNOS and TNF-a bearing cells were observed around inflammatory infiltrates and in the endoneurium of the spinal roots and the sciatic nerve. Some nerve fibers near to infiltrated regions showed a thinner or even fragmented myelin sheath. Some sciatic nerve axons exhibited a less intense, fragmented or clustered neurofilament immunolabelling. During recovery stage, rare iNOS/TNF-a immunoreactive cells were detected in vessels of T12-L3 spinal roots and the sciatic nerve. An increased number of these cells was observed in some nerve fibers of cauda equina. The peak stage of demyelination was verified in the sciatic nerve by the presence of several myelin ovoids. Neurofilaments showed continuous immunolabelling, but were more slender than the neurofilaments in naïve rats. Double-immunoreactive cells were not evidenced during the recovery stage. In nerve roots, the myelin sheath recovered its normal appearance, while in sciatic nerves, slenderer myelin sheaths and immunolabelled neurofilaments were observed among thicker ones. Our results suggest that there is a close association between the presence of iNOS and TNF-a bearing cells in the various regions of the peripheral nervous system and the clinical signs exhibited by the animals. Furthermore, the acute demyelinating process in sciatic nerves also promotes structural changes, probably affecting the normal functioning of axonsDoutoradoBiologia CelularDoutor em Biologia Celular e Estrutura

Estudo da degeneração Walleriana em camundongos isogenicos das linhagens C57BL/6J e A/J

Orientador : Francesco LangoneDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A axotomia em um nervo periférico leva ao desencadeamento do processo degenerativo na porção distal à lesão, denominado degeneração Walleriana (DW). Macrófagos e células de Schwann fagocitam e removem os axônios e a mielina em degradação. Além disso, tais células também são responsáveis pela preparação do microambiente adequado à regeneração axonal, através da produção de moléculas com propriedades neurotróficas e neurotópicas. Dentre essas moléculas destacamse as citocinas, produzidas principalmente pelos macrófagos, os fatores neurotróficos e componentes da matriz extracelular, produzidos pelas células de Schwann. Recentemente, foram obtidas evidências de que o óxido nítrico (NO) estaria também envolvido no desenvolvimento da DW e, conseqüentemente, no processo de regeneração axonaL Contudo, pouco ainda se sabe sobre a participação dos macrófagos e células de Schwann na produção do NO no decurso da DW. Alguns trabalhos relataram que camundongos adultos da linhagem C57BU6J apresentam menor capacidade regenerativa axonal, após lesão do nervo ciático, quando comparados a outras linhagens isogênicas. O objetivo deste trabalho foi investigar possíveis diferenças no padrão temporal degenerativo das linhagens C57BU6J e AIJ, utilizando o modelo de seção do nervo ciática e impedindo-o de regenerar. Neste sentido, analisamos inicialmente o desaparecimento dos neurofilamentos axonais, a fragmentação e degradação da bainha de mielina e a atividade da NADPH-diaforase no coto distal do nervo após 1, 3, 5 e 7 días da axotomia. A quantificação estereológica dos neurofilamentos marcados imunoistoquimicamente mostrou que a defosforilação e degradação são mais precoces na linhagem C57BU6J do que na linhagem AIJ. A histoquímíca do Sudan BJack não revelou diferenças temporais na fragmentação da bainha de mielina entre as linhagens. Porém, evidenciou a presença de um maior número de células envolvidas na degradação da mielina nos camundongos C57BU6J, 3 e 5 dias após a lesão. Por sua vez, a técnica histoquímica para NADPH-diaforase, indicadora da produção de NO, revelou que células presentes no coto distal em degeneração expressaram atividade NADPH-diaforase do 1° ao 7° dia após axotomia, em ambas as linhagens. Contudo, 5 dias após a lesão, as células NADPH-diaforase positivas na linhagem C57BU6J apresentaram, predominantemente, uma marcação intensa e bem delimitada, ao passo que na linhagem AlJ foram mais abundantes aquelas com marcação granular e dispersa. Com o objetivo de melhor compreender a participação do NO na DW, utilizamos técnicas de imunofluorescência e microscopia confocal para identificar as células envolvidas na produção de NO e também analisar a expressão temporal e espacial da isoforma induzível da óxido nítrico sintase (iNOS) após a seção do nervo ciático. Observou-se que a imunoreatividade para iNOS foi intensa em macrófagos e menos evidente nas células de Schwann, estando presente em ambos tipos celulares desde o 10 ao 70 dia após a lesão, para ambas linhagens. Contudo, os macrófagos constituíram o mais abundante contingente celular expressando iNOS. Além disso, na linhagem C57BU6J parece ter havido um ligeiro retardo para o início do recrutamento e ativação dos macrófagos quanto à expressão de iNOS no decorrer da DW, comparativamente à linhagem AIJ. Nossos resultados revelaram diferenças entre as linhagens AIJ e C57BU6J quanto a importantes eventos da DWe que parecem refletir diferentes propriedades intrínsicas dos axônios, bem como diferenças comportamentais em algumas células, talvez sob a ação de citocinas. Tais diferenças entre as linhagens devem ser consideradas em trabalhos de degeneração e regeneração nervosa periféricaAbstract: Axotomy of a peripheral nerve leads to a degenerative process in the distal stump known as Wallerian degeneratíon (DW), in which macrophages and Schwann cells participate ín phagocytosis ofaxon and myelin debris. Such cells are also responsible for preparing a favorable microenvironment to axonal regeneration through production of neurotrophic and neurotopic substances. Among these substances are cytokines produced mostly by macrophages and neurotrophic factors and components of extracellular matrix produced by Schwann ceUS. Recently, evidence emerged showing that nitric oxide (NO) would also be involved in DWand, consequently in lhe axonal regeneration processo However, partícipation of macrophages and Schwann cells in NO production during DW remains to be investigated . It has been reported in the literature that adult C57BU6J mire have a lower axonal regeneration potential afier sciatic nerve lesion when compared to olher ísogenic strains. The aim of this work was to investigate possíble differences in time course of some events in DW process between C57BU6J and AIJ strains, by using complete sciatic nerve transection model with prevented axonal regeneration. First, we studied the time course of neurofilament breakdown, fragmentation and clearance of myelin sheath and NADPH-diaphorase activity in the distal stump, 1, 3, 5, and 7 days afier axotomy. The stereologicaJ analysis of immunoreactive neurofilaments showed lhat the dephosphorylation and degradation process of these elements in C57BU6J strain is faster than in AIJ strain. On the olher hand, Sudan Black histochemistry did noí show differences between strains as regards the time course of myelin sheath fragmentation. However, jt was evident that a higher number of cells were involved in myelin degradation in C57BU6J mice at 3 and 5 days post-surgery. NADPH-diaphorase histochemistry, a marker for NO production, showed positivecells in the distal stump of both strains from the first to the seventh day afier lesion. Positive-cells in C57BU6J strain showed predominantty an intense and well defined labeling 5 days afier transection, while in AlJ strain granular and dispersed labeling were more abundant. With the goal of better understanding NO involvement in DW, immunofluorescence techniques and confocal microscopy were used to identify ceUs related to NO production and to examine the spacial and temporal expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) afier sciatic nerve transection. Immunoreactivity for iNOS was intense in macrophages and less evident in Schwann cells, but it was present in both cells trom the first to the seventh day afier transection in both strains. Macrophages were the main source of iNOS. We noted a delay in macrophage recruitment and activatíon of iNOS expression in the dista! stump of C57BU6J mire when compared to AJJ mies. These differences in DW between C578U6J and AIJ mice may reflect intrinsic properties ofaxons and/or behavioral dífferences in some cells, probably due influence of cytokines. These dífferences between strains should be taken into account in studies of degeneration and regeneration of the peripheral nervous systemMestradoMestre em Biologia Celular e Estrutura