Pedagogic Content Knowledge (PCK) in university Biotechnology teaching. The microbial specific growth rate (μ) case

En este trabajo se presenta un análisis de las ideas relacionadas al concepto de velocidad específica de crecimiento microbiano (μ) que presentaron estudiantes universitarios que cursaban la orientación en biotecnología del último año de la carrera de Bioquímica (Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina). El estudio se realizó en base a las respuestas que dieron los estudiantes, de manera anónima,  frente a la solicitud espontanea de que explicaran qué entendían por μ. El análisis se focalizó en la identificación de los factores que podrían relacionarse con las ideas que mostraron los estudiantes, entre las que se el tratamiento previo del concepto, la tendencia a la reducción funcional, el pragmatismo y la posibilidad de que se trate de concepciones alternativas pero en un campo muy específico y aplicado de las ciencias como es la biotecnología. Se plantean estrategias aplicadas para la reconstrucción del concepto de μ considerando estos factores. Las experiencias y conclusiones que surgen de este trabajo pretenden contribuir al desarrollo del conocimiento didáctico del contenido (CDC) en ciencias aplicadas en general, y para la biotecnología en particular.In this work, a study based on the university student’s conception about microbial specific growth rate (μ) is presented. The study was focused on last year students of the Biochemist career (Buenos Aires University, Argentina). It was developed considering the answers given anonymously by the students when they were spontaneously asked about the meaning of μ. The analysis was focused in the identification of factors which could be related with the students´ ideas about μ, such as the previous work with the subject, the tendency to the functional reduction, the pragmatisms and the possibility of alternative conceptions, but related with a specific field of applied sciences, such as biotechnology. Strategies aiming to the reconstruction of the μ concept were proposed considering these factors. The experiences presented in this work will contribute to the development of the Pedagogical Content Knowledge (PCK) in applied sciences, particularly in biotechnology.Fil: Ruberto, Lucas Adolfo Mauro. Universidad de Buenos Aires; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay; ArgentinaFil: Mac Cormack, Walter P.. Universidad de Buenos Aires; ArgentinaFil: Calabró López, Roberto Ariel. Universidad de Buenos Aires; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay; ArgentinaFil: Rodriguez Talou, Julian. Universidad de Buenos Aires; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay; Argentin

Producción de antraquinonas por cultivo in vitro de suspensiones celulares y raíces transformadas de Rubia tinctorum: un modelo para la enseñanza en el estudio de bioprocesos por cultivo de tejidos de plantas

El cultivo vegetal in vitro es una alternativa atractiva y factible para la producción de metabolitos secundarios. Este tipo de cultivos asegura una producción continua en condiciones controladas, bajo Buenas Prácticas de Fabricación. Estos procesos biotecnológicos constituyen una excelente herramienta para la formación de estudiantes de postgrado. Efectivamente, los estudiantes pueden adquirir experiencia en diferentes áreas, tales como bioquímica vegetal, biología molecular, metabolismo primario y secundario vegetal e ingeniería bioquímica. En este trabajo, la producción de antraquinonas en diferentes cultivos vegetales in vitro de Rubia tinctorum se presenta como un modelo sencillo y versátil para introducir a los estudiantes de postgrado en la producción de metabolitos secundarios vegetales. Los estudiantes pudieron analizar la cinética de formación de biomasa y productos en cultivos en batch de suspensiones y raíces transformadas, evaluando el efecto de la elicitación con metiljasmonato, una estrategia muy conocida utilizada para inducir la producción de metabolitos secundarios en cultivos de células vegetales. Además, se evaluó el efecto de la remoción in situ del producto, ampliamente utilizada en biocatálisis y fermentaciones microbianas. El resultado de las autoevaluaciones reveló que el trabajo en el laboratorio y el subsiguiente análisis de resultados favorecieron la consolidación de conceptos teóricos adquiridos durante los seminarios. En resumen, se presenta un trabajo de laboratorio económico, accesible y robusto, aplicable a estudiantes de cursos de postgrado en diferentes programas de biotecnología vegetal, química e ingeniería bioquímica. Palabras clave: trabajo de laboratorio, aprendizaje práctico, producción de metabolitos secundarios, cultivo de células vegetales, remoción in situ de producto.Plant cell culture bioprocesses constitute an excellent tool for the formation of undergraduate, magister, and Ph.D. students. In fact, students can acquire experience in the field of plant biochemistry and molecular biology; plant primary and secondary metabolism; and biochemical engineering. In the present manuscript, the production of anthraquinones in different plant cell tissue cultures is showed as easy and versatile model to introduce magister students in the field of plant secondary metabolite production. AQs are extracted with ethanol 80% and spectrophotometrically quantified, which also makes it environmentally friendly and easy to manipulate in the laboratory. The students were able to analyse biomass and product formation kinetics in batch suspension and hairy root cultures and evaluate the effect of MeJa elicitation an extended used strategy to trigger secondary metabolite production in plant cell cultures. Moreover, the performance of in situ product removal, which has been extensively used in biocatalyst and microbial fermentations, was evaluated. In summary, an inexpensive, accessible, and robust laboratory work is presented that can be adapted to undergraduate, magister, and/or Ph.D. students´ courses in different plant biology, chemistry, and biochemical engineering programs.Fil: Perassolo, Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; ArgentinaFil: Busto, Víctor Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Minoia, Juan Mauricio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; ArgentinaFil: Cerezo, Julieta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; ArgentinaFil: Smith, María Emilia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Martínez, C. A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Quevedo, Carla Verónica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Giuletti, A. M.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Rodriguez Talou, Julian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; ArgentinaFil: Cardillo, Alejandra Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentin

Methanotrophy, Methylotrophy, the Human Body and Disease

Methylotrophic Bacteria use one-carbon (C1) compounds as their carbon source. They have been known to be associated to the human body for almost 20 years as part of the normal flora and were identified as pathogens in the early 1990s in end-stage HIV patients and chemotherapy patients. In this chapter, I look at C1 compounds in the human body and exposure from the environment and then consider Methylobacterium spp. and Methylorubrum spp. in terms of infections, its role in breast and bowel cancers; Methylococcus capsulatus and its role in inflammatory bowel disease, and Brevibacterium casei and Hyphomicrobium sulfonivorans as part of the normal human flora. I also consider the abundance of methylotrophs from the Actinobacteria being identified in human studies and the potential bias of the ionic strength of culture media and the needs for future work. Within the scope of future work, I consider the need for the urgent assessment of the pathogenic, oncogenic, mutagenic and teratogenic potential of Methylobacterium spp. and Methylorubrum spp. and the need to handle them at higher containment levels until more data are available

In situ removal of consensus dengue virus envelope protein domain III fused to hydrophobin in Pichia pastoris cultures

This work describes a novel strategy for the integrated expression and purification of recombinant proteins in Pichia pastoris cultures. Hydrophobins can be used as fusion tags, proteins fused to them alter their hydrophobicity and can be purified by aqueous two-phase systems (ATPS) based on non-ionic surfactants. Here, the consensus dengue virus envelope protein domain III fused to hydrophobin I of Trichoderma reesei was expressed in Pichia pastoris cultures and an in situ product removal by an ATPS using a non-ionic detergent, (Triton X-114) was performed. The protein was produced and purified directly from the yeast culture supernatant both efficiently and with no loss. The purified protein was properly immobilized by adsorption in solid phase and recognized by anti-dengue antibodies, showing its potential for the development of an indirect immunoassay for dengue virus.Fil: Cerezo, Julieta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Smith, María Emilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Rodriguez Talou, Julian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentin

Cyclodextrins: A tool in plant cell and organ culture bioprocesses for the production of secondary metabolites

Plant cell culture bioprocesses have become an alternative source for bioactive compound production to the traditional extraction technology from plants grown in nature or through agricultural techniques. Thus, environmental conditions could make the supply of these secondary metabolites intermittent and heterogeneous. Therefore, plant cell cultures assure a continuous product supply, homogeneous production, fulfilling GMP requirements. Elicitation has been an extensively used strategy to boost secondary metabolite production in plant cell cultures. Cyclodextrins, the naturally occurring cyclic oligosaccharides of glucose residues, has emerged as an elicitor that can trigger plant cell defense responses and secondary metabolite accumulation. Moreover, CDs can form complex with most of the plant secondary compounds, thus contribute to product removal, which results in the elimination of feedback inhibition of product biosynthesis and also prevents product degradation and toxicity against the plant cells. In the present manuscript, we collect and compare the effects of cyclodextrins on different secondary metabolite pathways in plant cell culture processes. We review different case studies, which includes the production of phenylpropanoids, terpenes, alkaloids, naphthoquinones and anthraquinones derivatives. In the present manuscript, we collect and compare the effects of cyclodextrins on different secondary metabolite pathways in plant cell culture, which include the production of phenylpropanoids, terpenes, alkaloids, naphthoquinones and anthraquinones derivatives.Fil: Cardillo, Alejandra Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Perassolo, Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; ArgentinaFil: Giulietti, Ana Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; ArgentinaFil: Rodriguez Talou, Julian. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentin

Exploring different strategies to express Dengue virus envelope protein in a plant system

Dengue virus envelope glycoprotein (E-protein) is the main protein associated with immunity induction. To produce a candidate for subunit vaccines and to provide an antigen for diagnostic kits, it was expressed in a novel plant system using deconstructed viral modules. A truncated version of the E-protein was designed to be expressed alone and co-expressed with Dengue virus structural proteins. As well, the critical domain III of E-protein was fused to hepatitis B core antigen (HBcore). The recombinant proteins were produced in Nicotiana benthamiana plants and were reactive with the anti-E antibody. The fusion was reactive with both anti-E and anti-HBcore antibodies.Fil: Martinez, Carolina Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Topal, Emel. Arizona State University; Estados UnidosFil: Giulietti, Ana Maria. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Rodriguez Talou, Julian. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Mason, Hugh. Arizona State University; Estados Unido

Production of tropane alkaloids by biotransformation using recombinant Escherichia coli whole cells

Tropane alkaloids, such as hyoscyamine, 6β-hydroxyhyoscyamine and scopolamine, are secondary metabolites that were traditionally applied in medicine due to their anticholinergic activity. Hyoscyamine is converted into 6β-hydroxyhyoscyamine and scopolamine by Hyoscyamine-6β-hydroxylase (H6H). Nowadays, these bioactive compounds are obtained from natural producer plants due to the cost and complexity of their chemical synthesis. In the present work we explored the development of an alternative strategy for the production of the most valuable alkaloids, 6β-hydroxyhyoscyamine and scopolamine, using Escherichia coli harboring the H6H enzyme as biocatalysts. In addition, the protein extracts of the induced bacteria were assayed for the transformation of hyoscyamine into the more valuable alkaloids. For this purpose the h6hcDNA, previously amplified from Brugmansia candida total RNA preparations, was inserted in frame to the trx tag into the pET32a(+) vector. E. coli Origami strains were used as host for the expression. The strategy allowed us to produce enough quantities of a soluble and functional enzyme. Protein extracts and whole cells of the induced bacteria were able to transform hyoscyamine into the valuable products. In addition, we found that except from 2-oxoglutarate, no supplementation of the reaction mixture with the cofactors and co-substrates was needed. The process developed in this work is attractive since it could become an alternative to the traditional isolation of 6β-hydroxyhyoscyamine and scopolamine.Fil: Cardillo, Alejandra Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología; ArgentinaFil: Perassolo, Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología; ArgentinaFil: Sartuqui, Mariela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología; ArgentinaFil: Rodriguez Talou, Julian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología; ArgentinaFil: Giulietti, Ana Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología; Argentin

Biosynthesis in plants and metabolic engineering for their biotechnological production

In the present chapter, we review some aspects of sesquiterpene lactones biosynthesis regulation in different medicinal and aromatics plant used in the pharmaceutical industry. That includes, the mevalonate pathway and the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate pathway involved in isoprenoids precursors production (isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate) as well as the late pathways that lead with STL biosynthesis. The chapter also describe the transcription factors, which regulate sesquiterpene lactones biosynthesis and have been recently isolated and characterized by different research groups.We also review the different biotechnological approaches that have been developed for their production. In vitro plant cell cultures, comprising micropropagation, plant cell suspension, shoot and root cultures, offer controlled system and shorter production cycles and emerged as the first strategy as a production platform for many plant secondary metabolites. The characterization and isolation of genes involved in the regulation of sesquiterpene lactones biosynthetic pathways allowed the design of metabolic engineering strategies to increase the production of these metabolites. We discuss the different strategies performed to increase sesquiterpene lactones production by means of genetic engineering. An especial focus in the metabolic engineering of the artemisinin biosynthetic pathway in Artemisia annua is discussed. This metabolic pathway has become as a model system not only for the biotechnological production of sesquiterpene lactones but also for the improvement of other plant secondary metabolic pathways. Finally, we discuss the successful expression of the complete artemisinin biosynthetic pathway in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, which lead to the efficient accumulation of artemisinic acid in these microorganisms.Fil: Perassolo, Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Cardillo, Sabrina Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Busto, Víctor Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Giulietti, Ana Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Rodriguez Talou, Julian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentin

Recycling of hyoscyamine 6β-hydroxylase for the in vitro production of anisodamine and scopolamine

Abstract: The tropane alkaloids hyoscyamine, anisodamine, and scopolamine are extensively used medicines. In particular, scopolamine has the greatest value in the market. Hence, strategies to enhance its production have been explored as an alternative to traditional field-plant cultivation. In this work, we developed biocatalytic strategies for the transformation of hyoscyamine into its products utilizing a recombinant Hyoscyamine 6β-hydroxylase (H6H) fusion protein to the chitin-binding domain of the chitinase A1 from Bacillus subtilis (ChBD-H6H). Catalysis was carried out in batch, and recycling of H6H constructions was performed via affinity-immobilization, glutaraldehyde crosslinking, and adsorption–desorption of the enzyme to different chitin matrices. ChBD-H6H utilized as free enzyme achieved complete conversion of hyoscyamine in 3- and 22-h bioprocesses. Chitin particles demonstrated to be the most convenient support for ChBD-H6H immobilization and recycling. Affinity-immobilized ChBD-H6H operated in a three-cycle bioprocess (3 h/cycle, 30 °C) yielded in the first and third reaction cycle 49.8% and 22.2% of anisodamine and 0.7% and 0.3% of scopolamine, respectively. However, glutaraldehyde crosslinking decreased enzymatic activity in a broad range of concentrations. Instead, the adsorption–desorption approach equaled the maximal conversion of the free enzyme in the first cycle and retained higher enzymatic activity than the carrier-bound strategy along the consecutive cycles. The adsorption–desorption strategy permitted the reutilization of the enzyme in a simple and economical manner while exploiting the maximal conversion activity displayed by the free enzyme. This approach is valid since other enzymes present in the E. coli lysate do not interfere with the reaction. Key points: • A biocatalytic system for anisodamine and scopolamine production was developed. • Affinity-immobilized ChBD-H6H in ChP retained catalytic activity. • Enzyme-recycling by adsorption–desorption strategies improves product yields.Fil: Minoia, Juan Mauricio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; ArgentinaFil: Villanueva, María Emilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco; Argentina. Universidad Nacional de Luján. Departamento de Ciencias Básicas; ArgentinaFil: Copello, Guillermo Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Química Analítica y Fisicoquímica. Cátedra de Química Analítica Instrumental; ArgentinaFil: Rodriguez Talou, Julian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; ArgentinaFil: Cardillo, Alejandra Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología; Argentin

Anthraquinones production in Rubia tinctorum cell suspension cultures: Down scale of shear effects

The effect of turbulence on suspended cells is one of the most complex problems in the scale-up of cell cultures. In the present paper, a direct comparison of the effects of turbulence on suspension cultures of Rubia tinctorum in a standard bioreactor and in shake flask cultures was done. A procedure derived from the well known global method proposed by Nishikawa et al. (1977) was applied. Standard flasks and four-baffled shake flasks were used. The effect of turbulence and light irradiation on cell viability, biomass, and anthraquinones (AQs) production was evaluated. The biomass concentration and AQs production obtained using baffled shake flasks agitated at 360 rpm were similar to that achieved in R. tinctorum suspension cultures growing in a stirred tank bioreactor operating at 450 rpm, previously published (Busto et al., 2008). The effect of light on AQs production was found to be very significant, and a difference of up to 48% was found in cells with and without illumination after 7 days of culture. It is concluded that this down-scaled and simple flask culture system is a suitable and valid small scale instrument for the study of intracellular mechanisms of turbulence-induced AQs production in R. tinctorum suspension cultures.Fil: Busto, Víctor Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Biotecnología; Argentina;Fil: Calabró López, Roberto Ariel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Biotecnología; Argentina;Fil: Rodriguez Talou, Julian. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología. Cátedra de Biotecnología; Argentina;Fil: Giulietti, Ana Maria. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología; Argentina;Fil: Merchuk, José C.. Ben Gurion University of The Negev; Israel; Jerusalem College of Engineering. Department of Pharmaceutical Engineering; Israel