Molecular Diagnosis and Prognosis of Bladder Cancer : towards the implementation of molecular markers in clinical practice

Het urotheelcelcarcinoom (UCC) van de urineblaas is een serieus gezondheidsprobleem. Wereldwijd is 3.2% van alle nieuwe kankerdiagnosen aan deze ziekte toe te schrijven. UCC is de 5e meest voorkomende vorm van kanker en de 9e meest voorkomende vorm van kanker gerelateerde sterfte. De meeste patiënten (± 75%) presenteren zich met oppervlakkig UCC (pTa-pT1). Er zijn twee dilemma's bij het begeleiden van deze patiënten. Als eerste kenmerkt het oppervlakkig UCC zich door een hoge kans op één of meerdere recidieven (55­85%), waarbij de meeste recidieven gevonden worden in het eerste jaar na een transurethrale resectie (TUR). Deze recidieven worden gedetecteerd door middel van urethro-cystoscopie (UCS), de gouden standaard, die elke 3-4 maanden na een TUR wordt verricht, vaak in combinatie met urine cytologie (UC) als hulpmiddel. Na een recidief vrije periode van twee jaar kan de frequentie van de controles verlaagd worden. UCS en UC worden in de dagelijkse praktijk routinematig toegepast. UCS is echter invasief, vervelend voor de patiënten en duur. UC wordt helaas gekenmerkt door een lage sensitiviteit, met name voor laaggradig UCC. Er is derhalve ruimte voor verbetering, dat wil zeggen de ontwikkeling van methoden om oppervlakkige blaaskanker recidieven in urine te diagnosticeren en/of een subgroep van patiënten aan te wijzen die minder vaak gecontroleerd zouden kunnen worden. Een tweede punt van zorg bij het begeleiden van patiënten met UCC is het voorkomen van progressie (10-15%) naar spier-invasief carcinoom waaraan de patiënt mogelijk kan overlijden. De mogelijkheid om onderscheid te maken tussen oppervlakkige tumoren met en zonder invasieve capaciteiten zou klinisch van grote importantie zijn. Carcinoma in situ (CIS), een vlakke, hooggradige (G3) variant van oppervlakkig UCC is met name geassocieerd met een slecht ziekteverloop. Ondanks alles is het voorspellen van prognose voor een individuele patiënt met behulp van klinische en pathologische variabelen zeer moeilijk. Oppervlakkig UCC van een meer kwaadaardig phenotype kan wellicht in een vroeg stadium van de ziekte beter behandeld worden door middel van een radicale cystectomie. Dit verklaart waarom betere voorspellers voor UCC progressie nodig zijn. Met de recente vooruitgang in de moleculaire biologie, is ook de research steeds meer gericht op het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan blaascarcinogenese. Moleculaire markers zouden kunnen helpen bij het oplossen van de hierboven beschreven dilemma's. Als deze markers additionele waarde blijken te hebben ten opzichte van de huidige klinische en pathologische parameters, dan zouden ze onderdeel kunnen worden van de dagelijkse klinische praktijk. Dit proefschrift gaat over deze twee dilemma's t.a.v. de zorg voor patiënten met UCC. Moleculaire markers voor diagnose in urine en prognose van UCC werden geanalyseerd in verschillende klinische kaders. Deel één bevat een korte introductie over UCC in het algemeen en beschrijft de opzet van dit proefschrift (hoofdstuk 1). In het tweede gedeelte van het proefschrift evalueerden we in verschillende klinische kaders de Microsatelliet analyse (MA); een test gebaseerd op PCR reacties met DNA uit het urinesediment. Hoofdstuk 2 geeft een overzicht van de waarde van de huidige urine markers voor de diagnose van een recidief UCC. De sensitiviteit (patiënten met een recidief en een positieve urine test gedeeld door alle patiënten met een recidief UCC) en specificiteit (patiënten zonder recidief en een negatieve test gedeeld door alle patiënten zonder recidief UCC) werden bepaald voor 18 urine markers. Alle urine markers in het overzicht hadden een hogere sensitiviteit maar een lagere specificiteit voor recidief UCC dan de conventionele cytologie. De sensitiviteit nam toe met tumorgraad. In deze meta-analyse die alleen studies over recidief ziekte bevatte, was de sensitiviteit van de MA 82% en de specificiteit 89%. We vonden een behoorlijk lagere sensitiviteit t.a.v. recidief UCC voor 13/18 urine markers in vergelijk met eerdere overzichtsartikelen waarbij geen onderscheid gemaakt is tussen primair en recidief UCC. De reden voor deze lagere sensitiviteit is waarschijnlijk een hoger percentage klein, pTa en laaggradig UCC bij recidief laesies t.o.v. primaire tumoren. Vooralsnog ontbreekt voldoende klinisch bewijs om het cystoscopische controle schema te wijzigen m.b.v. een urine marker. Hoofdstuk 3 bevat een fase II studie over MA van urine die uitgevoerd werd in een dwarsdoorsnede van 109 patiënten die de polikliniek bezochten voor een controle UCS. Eerdere studies uitgevoerd in andere klinische kaders en met een lager aantal patiënten hadden reeds laten zien dat MA veelbelovend was om UCC in urine te diagnosticeren. Deze studie werd uitgevoerd om te onderzoeken of MA ook in staat was UCC te diagnosticeren bij patiënten die onder controle waren na een TUR. MA detecteerde 18/24 recidieven. De niet gevonden recidieven waren kleine pTaG1 laesies. In 5 van de 9 gevallen waarbij geen tumor werd gezien bij UCS maar waarbij MA wel positief was, werd toch nog een UCC gevonden binnen 6 maanden na MA. Bij dezelfde patiënten bleek MA sensitiever (74%) dan de BTAstat test (56%) en conventionele UC (22%). Nadelen van de MA waren de exclusie van 7 patiënten vanwege een onvoldoende hoeveelheid DNA in het urinesediment en 9 patiënten vanwege teveel leukocyten in de urine. Desondanks bleek MA een betrouwbare moleculaire test in urine om een recidief UCC te vinden, soms zelfs voordat er bij cystoscopie een recidief gezien werd. Hoofdstuk 4 gaat over MA in combinatie met de Fibroblast Groei Factor Receptor 3 (FGFR3) mutatie, een genetische marker voor gunstig UCC. Deze studie werd uitgevoerd om te onderzoeken of het mogelijk was de sensitiviteit van de MA te verhogen door de FGFR3 mutatie analyse eraan toe te voegen. De tests werden uitgevoerd op tumor- en urine monsters van 59 UCC patiënten waardoor er een directe vergelijking van de moleculaire veranderingen in tumor en urine mogelijk was. Conventionele cytologie werd gebruikt als referentie en een volledig klinisch rapport was beschikbaar van iedere patiënt. De UCCs met een hoger stadium en graad hadden meer microsatelliet veranderingen per tumor. Daarentegen werden FGFR3 mutaties alleen gevonden bij pTaG1-2 laesies. De sensitiviteit van de MA alleen was voor FGFR3 positief en negatief UCC respectievelijk 71% en 91%. Wanneer een microsatelliet verandering in tumor werd aangetoond, dan was de kans om dezelfde verandering ook in urine te vinden 35%. Dit was onafhankelijk van de FGFR3 status. De kans om dezelfde FGFR3 mutatie in urine te vinden was 52%. Veranderingen in de urine die niet in de corresponderende tumor gevonden werden, waren zeldzaam (1.8%). Door het combineren van de FGFR3 mutatie met de MA kon de sensitiviteit van moleculaire cytologie verbeterd worden tot 89% zonder daling van de specificiteit. De overeenkomst tussen de moleculaire profielen van urine en tumor in deze studie onderstrepen de clonale relatie van tumor cellen in de urine en de originele tumor(en). De waarde van de MA voor patiënten die gecontroleerd worden na bestraald te zijn op hun blaas is onderzocht in hoofdstuk 5. De controle van deze patiënten verloopt min of meer op dezelfde wijze als bij patiënten met oppervlakkig UCC. UCS en UC zijn echter vaak moeilijk te interpreteren na radiotherapie. Om die reden werd deze bijzondere groep patiënten getest m.b.v. MA. Hoewel er slechts 6 recidieven gevonden werden bij 49 patiënten, ontdekte de MA er 5 van. De specificiteit van routine UC, MA en expert UC was respectievelijk 85%, 93% en 97%. Daarnaast was de negatief voorspellende waarde van MA (echt negatieve MA / alle negatieve MA uitslagen) 99% (70/71 urine monsters) bij deze groep. Dit laatste is met name interessant omdat de positief voorspellende waarde van de UCS (40% in deze serie) veel lager is na bestraling. De resultaten van deze studie laten zien dat de MA ook van waarde kan zijn bij patiënten die gecontroleerd worden na bestraling. Het derde deel van dit proefschrift gaat over de prognostische waarde van de FGFR3 mutatie bij UCC. De relatie van deze mutatie met een gunstig ziektebeloop en de relatie tot andere klinische variabelen en moleculaire markers werd bediscussieerd. Hoofdstuk 6 bevat een overzicht van de klinische, pathologische en moleculaire kenmerken van het (oppervlakkig) UCC. Het laatste gedeelte van dit hoofdstuk geeft een korte inleiding over het FGFR3 gen. De hoofdstukken 7 & 8 bevatten de eerste twee publicaties over het gunstige karakter van de FGFR3 mutatie bij het UCC. Een FGFR3 mutatie werd gevonden bij 70/98 (71%) van de pTaG1-2 UCC. Aan de andere kant had slechts 7% van de invasieve G3 tumoren zo'n mutatie. Verder was de mutatie afwezig in 20 gevallen van CIS wat ook weer wijst op het gunstige karakter van de FGFR3 mutatie bij het UCC. Witte bloedcellen en biopten van normaal urotheel bij patiënten met een FGFR3 mutatie in hun tumor lieten geen FGFR3 mutaties zien. Dit benadrukte het somatische karakter en de tumorspecificiteit van deze mutaties voor UCC. De FGFR3 mutatie was tevens geassocieerd met een lage recidief-frequentie van oppervlakkig UCC in het eerste jaar na een TUR. Bij 57 patiënten met oppervlakkig UCC, was slechts 6% van de UCS positief voor de patiënten met een FGFR3 mutatie. Dit was 28% voor de patiënten die geen FGFR3 mutatie in hun tumor hadden. Deze twee preliminaire studies maakten duidelijk dat FGFR3 het eerste gen is dat vaak gemuteerd is bij gunstig (pTaG1-2) UCC. Daarnaast suggereren de resultaten uit deze twee hoofdstukken dat de frequentie van UCS behoorlijk verlaagd zou kunnen worden voor de patiënten met FGFR3 positieve tumoren. In hoofdstuk 9 worden de resultaten van een grote, retrospectieve, multicentrische studie getoond. Het doel van deze studie was het vergelijken van de FGFR3 mutatie met andere moleculaire markers en het verkrijgen van een lange klinische follow-up. Tevens werd de reproduceerbaarheid van de pathologische graad en de moleculaire variabelen bepaald. De FGFR3 mutatie werd in deze studie van 286 patiënten met primair UCC vergeleken met de expressie van drie immunohistochemische markers (MIB-1, P53 en P27kip1) waarvan het bekend is dat ze correleren met prognose. Een FGFR3 mutatie werd gevonden bij 172/286 (60%) van de UCCs. G1 tumoren hadden een mutatie in 88% van de gevallen, G3 tumoren in 16%. Daarentegen werden aberrante expressie niveaus van MIB-1, P53 en P27kip1 gevonden bij respectievelijk 5%, 2% en 3% van de G1 tumoren en 85%, 60% en 56% van de G3 tumoren. De combinatie van FGFR3 en MIB-1 was significant in de multivariaat analyse met als eindpunten recidief frequentie, progressie en ziekte vrije overleving. Het verschil in klinisch beloop met betrekking tot progressie van oppervlakkig UCC was evident t.a.v. de combinaties FGFR3 mutatie / MIB-1 normaal (N=138) en FGFR3 wild type / MIB-1 verhoogd (N=47). Het was interessant dat de overige 61 patiënten met tumoren zonder FGFR3 mutatie en normale MIB-1 expressie of tumoren met een FGFR3 mutatie en tevens een hoge MIB-1 expressie, een nagenoeg identiek klinisch beloop hadden dat tussen de twee eerdere groepen lag en zich kenmerkte door een redelijke prognose. Dit resultaat stelde ons in staat een moleculair graderingsmodel voor UCC te propageren waarin 3 moleculaire graden te onderscheiden zijn (mG1-3): mG1 (goede prognose), mG2 (redelijke prognose) en mG3 (slechte prognose). Daarnaast was de moleculaire Graad reproduceerbaarder dan de pathologische graad (91% vs. 47-61%). Op basis van de hoofdstukken 7, 8 en 9 was het de conclusie dat de FGFR3 mutatie selectief de gunstige moleculaire “pathway” van papillair UCC karakteriseert. Verder is moleculair graderen een nieuw, eenvoudig en zeer reproduceerbaar instrument om de prognose van UCC te bepalen. Hoofdstuk 10 laat zien dat FGFR3 mutaties ook frequent voorkomen bij het papilloom wat een zeldzame afwijking van het urotheel is. Papillomen worden in het algemeen beschouwd als een aparte diagnostische entiteit vanwege hun benigne natuurlijk beloop. Daarom zijn ze ook in de 1998 World Health Organization / International Society of Urological Pathology consensus classificatie als zodanig geclassificeerd naast de papillaire urotheel-laesies met lage maligniteits potentie (PUN-LMP, G1) en de laaggradige papillaire urotheel carcinomen (LG-PUC, G1-2). In onze studie werden FGFR3 mutaties gevonden bij 9/12 papillomen en bij 68/79 pTaG1 laesies (na review geclassificeerd als PUN-LMP en LG-PUC in respectievelijk 62 en 17 gevallen). Naast papillomen van het urotheel werd de FGFR3 mutatie analyse ook verricht op 21 Brenner tumoren van het ovarium. Deze tumor werd gekozen vanwege de gelijkenis met laaggradig UCC vanuit cytologisch oogpunt. Desalniettemin werden er geen FGFR3 mutaties gevonden bij Brenner tumoren. Deze studie beschreef als eerste een genetisch defect bij papillomen van het urotheel. Verder suggereerden we dat vanuit een moleculair perspectief, de papillomen van het urotheel samen in één groep met alle andere goed gedifferentieerde tumoren van het urotheel geclassificeerd zouden moeten worden. Hoofdstuk 11 beschrijft de verdeling van FGFR3 mutaties en P53 over­expressie (als expressie niveau >10%) voor 260 patiënten met UCC. Zoals beschreven in de hoofdstukken 7 en 8, is het FGFR3 gen gemuteerd bij een hoog percentage van laaggradige UCCs. Het doel van deze studie was derhalve om de relatie tussen FGFR3 mutaties en over-expressie van het P53 tumor suppressor eiwit als uiting van een mutatie in het P53 gen te evalueren. De over­expressie van P53 en/of het mutant P53 gen zijn in eerdere studies beschreven als ongunstige markers m.b.t. het UCC. FGFR3 mutaties en P53 over-expressie zijn bij respectievelijk 59% en 25% van de tumoren gevonden. Samen beschrijven de FGFR3 mutatie en de P53 over-expressie 79% van de UCCs. Echter, veranderingen in FGFR3 en P53 kwamen slechts bij 5.7% van de UCCs tegelijkertijd voor. Omdat deze genetische veranderingen ook nog eens geassocieerd waren met tegenovergestelde klinische en pathologische parameters, opperden wij dat mutaties in FGFR3 en P53 twee verschillende genetische “pathways” in de pathogenese van UCC markeren. Hoofdstuk 12 geeft een overzicht van de verdeling van de FGFR3 mutaties die gevonden zijn in UCC en dezelfde mutaties in de kiembaan die verantwoordelijk zijn voor een grote verscheidenheid aan skelet afwijkingen. Bijna alle FGFR3 mutaties in eerdere studies m.b.t. UCC kwamen overeen met de mutaties die thanatophore dysplasie veroorzaken, een aangeboren afwijking die in het algemeen snel na de geboorte tot de dood leidt. Deze studie rapporteert enkele nieuwe FGFR3 mutaties bij UCC die gevonden zijn bij niet-lethale syndromen met skeletafwijkingen. Onder de voorwaarde dat de FGFR3 mutatie op zich voldoende is voor het aanmaken van een blaastumor, zou het dus wel eens zo kunnen zijn dat patiënten met een FGFR3 geassocieerde skeletafwijking en een relatief normale levensverwachting (bijvoorbeeld: Achondroplasie) een hogere kans hebben op het krijgen van blaastumoren in vergelijk met de algehele populatie.Urothelial cell carcinoma (UCC) of the urinary bladder is a serious health problem. The disease accounts for 3.2% of all new cancer cases worldwide. UCC of the bladder is the 5th most common cancer and the 9th leading cause of cancer death. In most patients (± 75%), UCC is superficial (i.e. pTa-pT1) at first presentation. There are two problems in the management of these patients. First, superficial UCC of the bladder is characterized by a high risk of recurrence (55­85%), with most recurrences in the first year after trans-urethral resection (TUR). These recurrences are detected by urethro-cystoscopy (UCS), the gold standard, which is performed every 3-4 months, often in combination with urine cytology (UC) as an adjunct. After a two-year recurrence free period, the intensity of follow up may be lowered. UCS and UC are routinely used in the daily clinical practice. However, UCS is invasive, bothersome for the patients and costly. Unfortunately, UC is characterized by a low sensitivity, especially for low grade UCC. Hence, there is room for improvement, i.e. a need for development of techniques to diagnose superficial bladder cancer recurrences in urine and/or to identify a subset of patients who require a less frequent follow up. The second concern in managing patients with UCC is to prevent progression (10-15%) to muscle invasive, potentially lethal UCC. The ability to distinguish superficial tumors with invasive capabilities from those unlikely to become invasive would be of great clinical benefit. Carcinoma in situ (CIS), a flat and high grade (G3) manifestation of superficial UCC is especially associated with an unfavorable disease course. However, individual prediction of prognosis by clinical and pathological features is still very difficult. Superficial UCC that maintains a more malignant phenotype might be better treated with radical cystectomy in an early stage of the disease. This explains the need for more accurate predictors of UCC-progression. With the recent advances in molecular biology, research is more and more focusing on understanding the molecular mechanisms associated with bladder carcinogenesis. Therefore, molecular markers may aid in solving the two UCC management problems outlined above. If molecular markers prove to have additional value over the established clinico-pathological variables, they could become part of the clinical practice. This thesis deals with these two problems concerning the management of patients with UCC. Molecular markers for diagnosis in urine and prognosis of UCC were analyzed in various clinical settings. Part one gives a short introduction on UCC in general perspective and contains the scope of this thesis (chapter 1). In the second part of the thesis, we evaluated Microsatellite analysis (MA); a test based on PCR reactions with DNA of the urine sediment, in different clinical settings. Chapter 2 provides an overview of the accuracy of the current urine markers to diagnose recurrent UCC. The sensitivity (patients with a recurrent lesion and positive urine test divided by all patients with recurrent UCC) and specificity (patients without recurrence and a negative test divided by all patients without recurrent UCC) were determined for 18 urine markers. All the urine markers reviewed had a higher sensitivity, but a lower specificity than conventional cytology for recurrent UCC. The sensitivities increased with tumor grade. In this meta-analysis confined to studies on recurrent disease, MA had a sensitivity of 82% and a specificity of 89% for detection of UCC recurrences. We found a considerably lower sensitivity to detect recurrent UCC for 13/18 urine markers in comparison with earlier review articles where no distinction between primary and recurrent UCC was made. The reason for this reduced sensitivity is most likely a higher percentage of small, pTa and low grade UCC among recurrent lesions compared to primary tumors. At this time, sufficient clinical evidence to change the cystoscopic follow-up scheme with the use of a urine marker is not available. Chapter 3 describes a phase II study on urinary MA, which we performed in a cross-section of 109 patients who visited the outpatient department for a follow-up UCS. Earlier investigations in other clinical settings and with a limited number of patients showed that MA had a high potential to diagnose UCC in urine. Our study was conducted to investigate whether MA was also capable of diagnosing UCC in patients who were under surveillance after TUR. MA detected 18/24 recurrent tumors. The undetected UCCs were small pTaG1 lesions. In 5 of 9 cases where no tumor was seen at UCS but MA was positive, an UCC was found within 6 months after MA. In the same group of patients, MA was more sensitive (74%) than the BTAstat test (56%) or conventional urine cytology (22%). A drawback of MA was the exclusion of 7 patients due to an insufficient amount of DNA in the urine sediment and another 9 patients with leukocyte abundance. Nevertheless, MA appeared a reliable molecular test in urine for detection of recurrent UCC, sometimes even before cystoscopical evidence of the disease. Chapter 4 describes MA in conjunction with the Fibroblast Growth Factor Receptor 3 (FGFR3) mutation, a genetic marker for favorable UCC. This study was initiated to explore the possibility to improve the sensitivity of MA by adding FGFR3 mutation analysis to the molecular marker panel. The tests were carried out on tumor- and urine samples of 59 UCC patients allowing a direct comparison of molecular changes in tumor and urine. Conventional cytology was used as a reference and a full clinical record of each patient was obtained. UCCs with a higher stage or grade had more microsatellite alterations per tumor. Conversely, FGFR3 mutations were only found in pTaG1-2 lesions. The sensitivity of MA in FGFR3 positive and negative UCC was 71% and 91%, respectively. When a Microsatellite alteration was detected in tumor tissue, the chance to find the same alteration in the urine was 35% regardless of FGFR3 status. The chance to find the same FGFR3 mutation in the urine was 52%. Additional alterations in the urine that were not present in the UCC were only seldom reported (1.8%). By combining the FGFR3 mutation with MA, the sensitivity of molecular cytology could be enhanced to 89% without compromising specificity. The similarity of the molecular profiles in urine and tumor corroborate the clonal relation of tumor cells in the urine and the original tumor(s). In chapter 5, the value of MA for patients under surveillance after radiotherapy was investigated. The follow up o

Value of tissue markers p27kip1, MIB-1, and CD44s for the pre-operative prediction of tumour features in screen-detected prostate cancer

The pre-operative prediction of prognostic tumour features in the radical prostatectomy specimen using routine clinicopathological variables remains limited. The present study evaluated the predictive value of the cell-cycle protein p27kip1, the proliferation marker MIB-1, and the cell-adhesion protein CD44s, determined on the diagnostic needle biopsy of asymptomatic men screened for prostate cancer. Of 81 screen-detected prostate cancers, representative biopsy cores and matched radical prostatectomy specimens were immunohistochemically stained for these tissue markers. Conventional pre-operative and post-operative clinicopathological variables were assessed and cancers were divided according to a validated tumour classification model (potentially harmless, clinically significant). Low (<50%) p27kip1 expression, high (≥10%) MIB-1 expression, and low (<25%) CD44s expression were considered adverse prognostic signs. Binary logistic regression analysis was performed to assess the most valuable predictors of clinically significant disease. An adverse prognostic immunostaining assessment on the biopsy was found in 10 (12.3%), 17 (21.0%), and 25 (30.9%) cases for p27kip1, MIB-1, and CD44s, respectively. The concordance in tissue marker assessment between the biopsy specimen and matched radical prostatectomy specimens was low for all three. The positive predictive value (PPV) of p27kip1 was 90.0%, remarkably higher than that of MIB-1 and CD44s (41.2% and 52.0%, respectively), indicating that a low radical prostatectomy p27kip1 score is expected if the biopsy p27kip1 score is low. Logistic regression analysis revealed that biopsy Gleason score (p<0.01) and p27kip1 assessment (p<0.01) remained the only significant predictors of clinically significant disease. All cases with low p27kip1 expression were found to have clinically significant disease after radical prostatectomy. The assessment of p27kip1 in the biopsy specimen might thus assist in distinguishing between potentially aggressive and potentially non-aggressive disease in prostate cancer screening. Copyrigh

FGFR3 and P53 characterize alternative genetic pathways in the pathogenesis of urothelial cell carcinoma

Fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) and P53 mutations are frequently observed in bladder cancer. We here describe the distribution of FGFR3 mutations and P53 overexpression in 260 primary urothelial cell carcinomas. FGFR3 mutations were observed in 59% and P53 overexpression in 25%. Interestingly, FGFR3 and P53 alterations were mutually exclusive, because they coincided in only 5.7% of tumors. Consequently, we propose that they characterize two alternative genetic pathways in urothelial cell carcinoma pathogenesis. The genetic alterations were reflected in the pathology and the clinical outcome, i.e., FGFR3 mutations were found in low-stage/-grade tumors and were associated with a favorable disease course, whereas P53 alterations were tied to adverse disease parameters

Combined microsatellite and FGFR3 mutation analysis enables a highly sensitive detection of urothelial cell carcinoma in voided urine

PURPOSE: Fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) mutations were reported recently at a high frequency in low-grade urothelial cell carcinoma (UCC). We investigated the feasibility of combining microsatellite analysis (MA) and the FGFR3 status for the detection of UCC in voided urine. EXPERIMENTAL DESIGN: In a prospective setting, 59 UCC tissues and matched urine samples were obtained, and subjected to MA (23 markers) and FGFR3 mutation analysis (exons 7, 10, and 15). In each case, a clinical record with tumor and urine features was provided. Fifteen patients with a negative cystoscopy during follow-up served as controls. RESULTS: A mutation in the FGFR3 gene was found in 26 (44%) UCCs of which 22 concerned solitary pTaG1/2 lesions. These mutations were absent in the 15 G3 tumors. For the 6 cases with leukocyturia, 46 microsatellite alterations were found in the tumor. Only 1 of these was also detected in the urine. This was 125 of 357 for the 53 cases without leukocyte contamination. The sensitivity of MA on voided urine was lower for FGFR3-positive UCC (15 of 21; 71%) as compared with FGFR3 wild-type UCC (29 of 32; 91%). By including the FGFR3 mutation, the sensitivity of molecular cytology increased to 89% and was superior to the sensitivity of morphological cytology (25%) for every clinical subdivision. The specificity was 14 of 15 (93%) for the two (molecular and morphological) cytological approaches. CONCLUSIONS: Molecular urine cytology by MA and FGFR3 mutation analysis enables a highly sensitive and specific detection of UCC. The similarity of molecular profiles in tumor and urine corroborate their clonal relation

Mechanistic target of rapamycin (MTOR) protein expression in the tumor and its microenvironment correlates with more aggressive pathology at cystectomy

Background: The mechanistic target of rapamycin (mTOR) has been implicated in driving tumor biology in multiple malignancies, including urothelial carcinoma (UC). We investigate how mTOR and phosphorylated mTOR (pmTOR) protein expression correlate with chemoresponsiveness in the tumor and its microenvironment at final pathologic staging after neoadjuvant chemotherapy (NAC). Methods: A single-institution retrospective analysis was performed on 62 patients with cT2–4Nany UC undergoing NAC followed by radical cystectomy. Diagnostic (transurethral resection specimens, TURBT) and postchemotherapy radical cystectomy specimens were evaluated for mTOR and pmTOR protein expression using immunohistochemistry of the tumor, peritumoral stroma, and normal surrounding stroma. Protein expression levels were compared between clinical and pathologic stage. Whole transcriptome analysis was performed to evaluate mRNA expression relative to mTOR pathway activation. Results: Baseline levels of mTOR and pmTOR within TURBT specimens were not associated with clinical stage and response to chemotherapy overall. Nonresponders with advanced pathologic stage at cystectomy (ypT2–4/ypTanyN+) had significantly elevated mTOR tumor staining (P = 0.006) and a sustained mTOR and pmTOR staining in the peritumoral and surrounding normal stroma (NS). Several genes relevant to mTOR activity were found to be up-regulated in the tumors of nonresponders. Remarkably, complete responders at cystectomy (ypT0) had significant decreases in both mTOR and pmTOR protein expression in the peritumoral and normal stroma (P = 0.01–0.03). Conclusions: Our results suggest that mTOR pathway activity is increased in tumor and sustained in its microenvironment in patients with adverse pathologic findings at cystectomy. These findings suggest the relevance of targeting this pathway in bladder cancer